质粒pLXSN介导CGRP基因治病大鼠珠网膜下腔出血后脑血管痉挛的研究

摘要

目的：构建带有降钙素基因相关肽基因的重组真核表达质粒pLXSN-CGRP。枕大池一次注血法制作大鼠蛛网膜下腔出血模型，以质粒pLXSN作为载体携带CGRP cDNA经立体定向侧脑室注入，观察蛛网膜下腔出血后基底动脉的痉挛程度及血浆CGRP蛋白的表达，探讨质粒pLXSN介导CGRP基因在蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)中的保护作用，为临床治疗脑血管痉挛提供新的思路和实验依据。
　　 方法：本实验以350g普通成年雄性SD大鼠为取材对象，从大鼠大脑皮层中获取总RNA，通过RT-PCR扩增得到CGRP基因全序列。通过双酶切、连接反应将CGRP基因导入质粒pLXSN载体上。通过转化、筛选、鉴定，成功构建重组质粒pLXSN-CGRP。体外转染人胚胎肾细胞293T，荧光定量PCR、Western-blotting检测CGRP的表达。提取及扩增质粒pLXSN和质粒pLXSN-CGRP。将36只300g-350g普通成年雄性SD大鼠均采用枕大池一次注血法制成大鼠蛛网膜下腔出血模型。随机分为3组：生理盐水组(n=12)、空载质粒组(n=12)和CGRP组(n=12)，采用立体定位的方式于SAH后立即经侧脑室分别注入生理盐水、质粒pLXSN和质粒pLXSN-CGRP20ul。HE染色法检测SAH后24小时各组基底动脉形态学改变，采用显微图像分析系统采集、分析各组标本图像。酶联免疫吸附测定法(Ellisa)分析各组血浆中CGRP蛋白的表达水平。
　　 结果：1、成功通过RT-PCR扩增得到CGRP目的基因序列，全长387bp;2、成功构建重组质粒pLXSN-CGRP，并转染293-T细胞，通过Q-PCR及Western-blot检测确认降钙素基因相关肽的表达；3、枕大池一次注血法成功制作大鼠蛛网膜下腔出血模型并探讨优化模型条件；4、与对照生理盐水动物组、空载质粒动物组相比，经pLXSN-CGRP质粒干预的实验动物组基底动脉痉挛程度较轻，表现为血管管腔内周长增加，血管壁厚度减小，有显著性差异(P＜0.05);pLXSN-CGRP质粒干预的实验动物组浆中CGRP蛋白表达量也显著性增大(P＜0.05)。
　　 结论：体外构建携带CGRP基因的重组真核表达质粒pLXSN-CGRP，转染293-T细胞后发现CGRP蛋白表达，经侧脑室注射导入SAH后CVS的大鼠模型内，在蛛网膜下腔出血早期就可以对比观察到脑血管痉挛得到有效地缓解。外源性基因导致CGRP表达量增高可能成为其主要机制。