拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin及联合多肽Scy-hepc的表达和抗菌、抗病毒功能研究

摘要

抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要组分,广泛存在于生物界的各个门类,进化上相对保守,具有广谱的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。抗菌肽具有可见的应用前景,但直接从动物体提取抗菌肽不适于未来产业化的要求。本研究利用本实验室分离鉴定的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin基因和大黄鱼抗菌肽Hepcidin基因,通过基因工程技术构建了Soygonadin基因及与大黄鱼抗菌肽Hepcidin基因联合的基因工程稳定表达菌株,优化其表达与纯化工艺,研究其基因表达产物的抗菌与抗病毒活性、抗菌机制以及抗菌(毒)谱,为未来抗菌肽的产业化提供技术支撑；同时利用基因表达产物制备Scygonadin的抗体,阐明了Scygonadin蛋白在雄性拟穴青蟹的组织表达定位,为Scygonadin目标性应用以及其功能的深入研究奠定基础。主要研究结果如下:
　　 1.Scygonadin基因在大肠杆菌中的表达及其抗菌活性:构建了Scygonadin基因的两种融合表达载体pTrc-CKS/scygonadin和pET28-scygonadin,融合蛋白CKS-scygonadin主要以可溶性形式表达,分子量为43kDa,经3C蛋白酶酶切,两次亲和纯化后,获得了11kDa的目的蛋白Seygonadin,产量为10.6mg/L。以pET28a为载体表达的Scygonadin主要以可溶性形式表达,经一次亲和纯化后即获得目的蛋白,产量为65.9mg/L。体外抗菌实验结果显示,上述两种原核表达的scygonadin抗菌谱相似,能选择性地抑制革兰氏阳性和阴性菌,在所测浓度下对酵母和真菌无抗性(>60μM)；30μM的Scygonadin能在较短时间内(30分钟)杀灭全部的金黄色葡萄球菌。比较发现,pET28-scygonadin是一个较理想的原核表达载体。
　　 2.Scygonadin基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性:体外构建了Scygonadin基因的真核表达载体pPIC9K—scygonadin,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导后在培养上清中检测到目的蛋白Scygonadin。并用亲和层析纯化表达产物,产量为20mg/L。与原核表达产物Scygonadin比较,真核表达的Scygonadin具有较强的抗菌活性。
　　 3.Scygonadin蛋白在雄性拟穴青蟹的组织定位:利用pET28-scygonadin表达纯化的Scygonadin蛋白免疫Balb/c小鼠,制备Scygonadin抗体。利用Scygonadin抗体,通过SDS-PAGE、Western—blot和质谱分析检测了成熟雄性拟穴青蟹各组织的表达情况,发现与其基因的表达相对应,Scygonadin蛋白在射精管中高表达,且显著高于其它组织。
　　 4.联合多肽Scy-hepc在大肠杆菌中的表达、抗菌活性和抗菌机理:根据Scygonadin和Hepcidin基因的cDNA序列,将两基因进行合理拼接,构建了联合多肽原核表达载体pET28-scy/hepc,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS菌株中诱导表达,获得24kDa的融合蛋白。利用pET28-scy/hepc表达载体的C端6×His-Tag,通过亲和层析纯化联合多肽Scy-hepc,产量为60mg/L。联合表达产物Scy—hepc具有较强的抑菌和杀菌能力,显著高于原核表达产物Scygonadin。Scy-hepc(12.5μM,MBC)可在30分钟杀灭90％以上的金黄色葡萄球菌,在1.5-2小时杀灭90％以上的施氏假单胞菌:Scy-hepc(50μM,MBC)对藤黄微球菌具有相对缓慢的杀菌过程,在4小时可杀死90％以上的藤黄微球菌。将原核表达的联合Scy-hepc与施氏假单胞菌孵育2小时后,通过扫描电镜观察到施氏假单胞菌表面结构崎岖不平,有泡状隆起,大量细菌可见内容物外泄。
　　 5.联合多肽Scy-hepc在毕赤酵母中的表达、抗菌活性:通过优化密码子,构建了三种Scygonadin和Hepcidin的真核串联表达载体,分别为pPIC9K—scy/hepc、pPIC9K-scy/hepc(6CAC)和pPIC9K-scy/hepc(6CAT),其中pPIC9K-scy/hepc转化毕赤酵母GS115后获得较高表达量。通过培养条件优化,Scy-hepc在培养基初始值为pH6.0,甲醇浓度为0.75％条件下,诱导表达36小时,可获得最高表达量,约为23mg/L。真核表达产物Scy-hepc具有广谱的抗菌活性,与原核表达产物Scy-hepc比较,真核表达的Sey-hepc抗菌活性更强,对水产致病菌如嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的抑杀菌活性(MIC1.6-3.2μM)显著高于原核表达产物Scy-hepc(MIC25-50μM)。
　　 6.重组表达的Scygonadin和Scy-hepc成熟肽的抗病毒活性:体外制备红螯螯虾的造血组织干细胞(Hpt),分别用真核表达产物Scygonadin、Scy—hepc和化学合成的Hepcidin成熟肽,以不同的方式作用于对虾白斑病毒(WSSV),通过检测病毒复制的极早期基因IE1的表达情况判断三种受试抗菌肽的抗病毒效果。实验结果显示:真核表达产物Scygonadin和Scy—hepc具有一定的抗病毒活性；而Hepcidin成熟肽具有显著的抗病毒活性,其不仅能够抑制WSSV对宿主细胞Hpt的吸附,而且能够抑制WSSV在宿主细胞内的复制。