甲基对硫磷和镉联合胁迫斑马鱼脑的毒性效应及其蛋白质组学研究

摘要

对多种污染物产生联合毒性效应的研究已成为环境科学发展的重要方向之一。目前，有关污染物的生物效应研究多数还是集中在单个化合物，因而有关预测和治理多种毒物对生物产生联合毒性的研究，越来越受到环境科学家的关注和重视，特别是有关有机磷农药和重金属的联合毒性效应研究。本文选取了在水体污染中比较有代表性的甲基对硫磷(MP)和重金属镉(Cd)为共污染物，以经典的模式生物斑马鱼(Danio rerio)为实验材料，从生理生化指标的变化、蛋白的差异表达等几方面对MP和Cd对斑马鱼脑组织的联合胁迫效应进行了较为系统的研究。
　　 首先，对MP和Cd分别胁迫斑马鱼后产生的急性毒性效应进行分析。结果显示MP对斑马鱼的半致死浓度(96 h-LC50)为6.3 mg/L，Cd对斑马鱼的96 h-LC50为8.3 mg/L；利用气相色谱(GC)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对MP和Cd共同存在时对彼此在斑马鱼脑中的富集影响进行了分析，结果表明两者在前24 h相互促进富集，24 h到96 h抑制彼此的富集，这说明MP和Cd共存时，联合毒物对斑马鱼的生存和毒性产生新的综合效应。
　　 其次，本文研究了MP和Cd联合作用下对斑马鱼脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽转移酶(GST)和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响，以探讨MP和Cd对斑马鱼的毒害效应以及应激机制，同时筛选出联合胁迫的酶蛋白标志物。结果表明，MP和Cd的联合胁迫能引起SOD、CAT、GST和AChE的的活性产生显著的变化趋势，酶活的变化与毒物的富集存在一定的相关性：MP和Cd的联合胁迫在前24 h促进了彼此的富集，使得毒性增加，进而抑制了酶的活性；从24 h到96 h联合胁迫作用抑制了彼此的富集，诱导更多的解毒酶发挥作用，使得酶活增加，从而降低了联合毒性，联合效应表现为拮抗作用。这四种酶活的变化趋势说明，斑马鱼脑产生的毒性效应是MP和Cd共同作用的结果，提示该系列指标可以作为MP和Cd胁迫的生物标志物。
　　 再者，选用差异蛋白质组学及相关分析技术筛选与鉴定由MP和Cd联合胁迫下斑马鱼脑组织表达的差异蛋白，并进一步筛选出关键蛋白，以探讨MP和Cd的联合效应和胁迫机制。质谱鉴定的16个差异蛋白质按功能分为五大类：细胞代谢、信号传导、受体系统、细胞骨架和应激蛋白，其中代谢相关蛋白占到50％，表明在MP和Cd的胁迫下，斑马鱼脑组织内的代谢过程受到了很大的影响；MPI、GSTM3、TCRa-V54、Keratin8和Hsp8在所有胁迫组中的表达量变化提示它们可能是作为有害物质胁迫下诱导产生的共同蛋白，可以作为监测环境污染情况的生物共性标记物；ALDOCB、DPYSL2和NDUFS1在MP单一胁迫组中的表达量呈现特异性上调，说明三者在机体抵抗MP的胁迫毒性方面起着重要的作用，潜在着作为监控有机磷农药污染程度的蛋白指示物；UQCRFS1和RPSA在Cd单一胁迫组中的表达量呈现特异性上调，认为可能参与Cd的解毒效应，适合作为监测Cd污染程度的特异性标志物；ALDH9AlA、SSADH、NDRG3、GSTM3和ATP5Al的表达有利于细胞的解毒，它们在联合胁迫组中的表达量呈现显著上调，提示联合作用下细胞的解毒能力增强，使得联合毒性减弱，说明这五种蛋白与联合效应作用有关，潜在着作为联合毒物效应的标志物；另外，TCRa-V54在单一胁迫组完全被抑制表达，而在联合胁迫组中只是表达下调，说明联合毒性对免疫系统的伤害小于单一毒性引发的伤害，从一定程度上也说明联合毒性减弱，二者联合胁迫时的毒性存在相互作用。上述描述的关键蛋白质对后续开展联合毒理机理的研究提供了科学依据和实验证据。实时定量PCR分析表明基因在mRNA的表达变化与相应蛋白表达变化水平呈正相关，western blotting表明TCRa-V54的表达与双向电泳的分析结果一致。这些实验结果进一步提高了已筛选与鉴定的差异蛋白的可信度。
　　 最后，选择在MP和Cd的联合毒性中起着重要解毒作用的GSTM3作为研究对象，对其进行了重组表达的研究。根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其密码子进行优化，根据蛋白酶GSTM3的氨基酸顺序合成了相应的cDNA，并成功构建了毕赤酵母表达载体pPIC9-GSTM3；将其通过电击转化整合入毕赤酵母GS115基因组中，实现了GSTM3蛋白在重组毕赤酵母宿主菌G115中的分泌表达；重组表达的GSTM3活性测定为192 U/mgprot，为正常斑马鱼脑组织中GSTM3活性(20.62 U/mgprot)的9.3倍，这说明毕赤酵母GS115可以作为表达斑马鱼脑组织中GSTM3的合适宿主，并可用于研究GST的解毒机制和分析其作为揭示有机磷农药和重金属联合毒性效应的蛋白标志物的可行性。