潜在有毒拟菱形藻比较蛋白质组学研究——软骨藻酸相关蛋白初探

摘要

拟菱形藻(Pseudo-nitzschia)是少数能够产生毒素的硅藻之一。它产生一种神经性毒素-软骨藻酸(Domoic acid，DA)，进而引发记忆丧失性贝毒(Amnesic shellfish poisoning，ASP)，而其产毒机理却尚未得以明确阐述。研究发现拟菱形藻产毒存在3个特点：a)不同种产毒能力不同；b)同种不同株系产毒能力不同；c)不同地理株系的产毒能力不同。
　　 本论文首先运用光学和电子显微镜对不同地理株系的四种拟菱形藻进行了形态学观察比较和特征描述；其次采用高效液相色谱(HPLC)的方法对各株系的产毒特性进行了检测；最后以多列拟菱形藻(P. multiseries)为模式种，不同产毒特性的株系为研究对象，运用双向凝胶电泳技术，建立了这一潜在有毒赤潮藻的蛋白质组图谱，引入比较蛋白质组学概念，初步比较了产毒特性不同的株系在蛋白质表达水平上的差异，并进一步采用生物质谱技术鉴定出16种蛋白质可以作为产毒拟菱形藻中一批潜在特异性生理标记物，探讨了这些蛋白质在拟菱形藻生活史中及赤潮形成中的作用。主要结果如下：
　　 1．鉴定了不同地理株系的拟菱形藻四个种类(P. multiseries, P. subfraudulenta, P. calliantha,P.brasiliana)，观察了多列拟菱形藻不同产毒株系在光学显微镜和电子显微镜下的形态学差异，没有发现明显的形态学差异；
　　 2．在四种拟菱形藻中，只有多列拟菱形藻(P. multiseries)检测到毒素，结合其生长曲线与产毒变化曲线，发现其单个细胞的产毒最高时期均处于稳定期的后期；
　　 3．对三种拟菱形藻(P. subfraudulenta, P. calliaruha, P. brasiliana)全细胞蛋白质进行蛋白质组学差异分析，结果显示可以将双向凝胶电泳蛋白质图谱作为拟菱形藻属下种类鉴定的依据之一；
　　 4．蛋白质双向电泳结果发现，多列拟菱形藻(P. multiseries)产毒株系(toxic strains)与不产毒株系(non-toxic strains)全细胞蛋白质表达存在差异，共找出16个差异蛋白点，确定为潜在产毒标记物；
　　 5．通过对蛋白质二级质谱的同源性搜索，从中找到了4个已知蛋白质、3个未知蛋白质；通过蛋白质一级质谱分析和同源搜索找到了9个差异蛋白质，这些差异蛋白可以作为拟菱形藻的产毒标志物，主要与能量的代谢、光合作用以及细胞对胁迫环境的响应相关的酶类有关。