深海油脂酵母筛选及利用糖蜜发酵生产微生物柴油的初步研究

摘要

本论文磨合当前所关注的有关深海微生物、生物能源、废物综合利用3个热点问题,采用荧光观测和气相色谱质谱联用等技术,筛选深海油脂酵母,利用糖蜜发酵生产微生物油脂并初步探讨将其转化为柴油的工艺。本研究主要由国家海洋局基本科研业务费专项资金项目(2010009)资助,于海洋三所国家海洋局海洋生物遗传重点实验室完成。主要结果如下:
　　 采用培养基添加尼罗红后检测菌落荧光情况(在紫外灯下)的方法对大洋DY115-19、DY115-20航次分离获得的385株酵母进行产油菌株的初筛,总共获得22株产油酵母,其中20株来自西太平洋暖池区,2株来自东太平洋多金属结合区。所得产油酵母经葡萄糖摇瓶发酵培养后,采用有机溶剂法进行复筛,结果显示除6株酵母外(油脂含量接近20％),其余16株均为高产油脂酵母(油脂含量29.3％-62.9％)。
　　 通过26SrDNA D1/D2区的序列分析方法对22株高产酵母菌株进行分子鉴定,并结合早期鉴定结果,对总共110株产油及非产油酵母进行了统计。结果显示不同种类酵母在深海中分布数量存在较大差异,在所有检测到的15种酵母中,相对数目分布较多的为Candida parapsilosis,Debaryomyces hansenii、Rhodosporidium paludigenum、Candida tropicalis。而筛选到得产油酵母仅分布于6个种,其中出现比例最高的为Candida viswanathii,其次为Rhodosporidiumpaludigenum,表明深海产油酵母种类与目前常见的产油酵母一致,但种类分布更加狭窄。
　　 考虑到油脂生产成本,寻找可利用廉价底物高产油脂的微生物具有深远的意义。本文分别选择葡萄糖及廉价的糖蜜作为碳源,比较16株产油酵母在两种培养基中产油性能差异,结果显示所有酵母在葡萄糖培养基中具有稳定的产油能力。而在糖蜜培养基中,虽然多数酵母菌株生长旺盛,但油脂含量却大幅度下降,除近平滑假丝酵母2A00015产油能力未发生太大变化外(油脂含量40.81％,油脂系数10.93),其他酵母菌株油脂含量均低于30％。表明糖蜜中存在某种影响因素阻碍了大多数酵母油脂合成,而酵母2A00015可能存在特殊的油脂代谢途径或产生特殊物质可抵抗不良因素的影响,因此我们选择该酵母作为后续扩大培养的试验菌株。
　　 由于传统有机溶剂法提取酵母油脂需要消耗大量时间及有机溶剂,而且还容易产生环境污染。因此,在优化糖蜜培养基及培养条件之前,建立了一套以产油酵母2A00015为试验菌株,利用尼罗红特性快速测定油脂含量的简便方法,该测定方法得到相对荧光强度与称重法得到油脂含量呈正相关性(R2=0.9608)。以上述方法作为油脂检测手段,并结合正交设计和单因子试验对2A00015酵母菌株的培养基及发酵条件进行优化,最后确定培养基最佳氮源为硫酸铵,最优培养基成份为糖蜜(总糖浓度)110 g/L,硫酸铵1.0 g/L,酵母粉0.8 g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,碳氮比为137:1,相对油脂合成而言,糖蜜的浓度影响最大,其次分别为硫酸铵和磷酸二氢钾,酵母粉的影响最小。最佳发酵条件包括,摇瓶装液量50mL/250mL,接种量为10％,初始pH5.0,培养基盐度30％,培养温度27℃。另外,我们还考察Mg2+、Fe2+,Mn2+、Zn2+、Cu2+5种金属离子对酵母油脂合成的影响,结果显示除Cu2+外,其他4种金属离子在一定浓度下均可提高油脂含量。经过上述优化后得到菌体生物量和油脂产量分别为15.28 g/L、8.74 g/L,与未优化前比较,生物量提高35.94％,油脂产量提高90.4％。
　　 本文还对酵母油脂提取工艺及生物柴油制备方法进行初步探索,确定了冻融-酸热法(少量样品)和高压均质机法(大量样品)为最佳细胞破碎方法,乙醚-石油醚(2:1)混合液为最佳有机溶剂提取液。并在离子液体催化酯交换反应制备生物柴油过程中,对醇油比、反应温度、反应时间、催化剂使用量进行了优化。所得生物柴油经气相色谱-质谱(GC/MS)测定,其主要成分为:亚油酸甲酯40.98％,油酸甲酯32.18％,硬脂肪酸甲酯16.07％,棕榈酸甲酯4.01％,花生烯酸甲酯3.2％,其他2.9％。