来源于红树林湿地沉积物的细菌对多环芳烃(PAHs)降解的研究

摘要

多环芳烃(PAHs)是一类由两个或两个以上苯环组成的持久性有机化合物，在环境中广泛分布，以其致癌、致畸、致突变性严重威胁着生态环境和人类健康。微生物降解是环境中PAHs去除的主要途径，而对PAHs微生物降解机制的阐明成为PAHs生物修复领域中的研究热点。
　　 本研究将采集自漳州浮宫红树林湿地沉积物样品，在持续性的高浓度、混合PAHs选择压力下进行富集驯化，获得新型、具有高效PAHs降解能力的微生物，同时对筛选获得的PAHs降解菌从生理生化角度、基因组学、蛋白质组学和转录组学等方面进行了探索性的研究，探讨其降解特性，捕捉相关功能基因及功能酶，并在这些基础上推测其代谢途径。通过研究，获得的主要结果如下:
　　 1.利用高浓度(1000 mg L-1)、混合PAHs（菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘）为碳源，结合改良的平板升华法，从漳州浮宫红树林湿地沉积物样品筛选到3株具有PAHs降解能力的可培养单菌，编号为F2，F19和B17。16S rRNA基因鉴定结果显示这三株细菌分别为新鞘氨醇菌属（Novphingobium）、海细菌属（Marinobacterium）和海杆菌属（Marinobacter）。菌株F2与Novosphingobiumpentaromativorans US6-1T的相似度为99.9％，菌株F19与Marinobacterium litoraleIMCC1877T相似度最高，达到96.8％，菌株B17与Marinobacter mobilis CN46T的相似度最高，达到97.9％。通过生理生化特性、脂肪酸成分的分析，G+C mol％的测定和DNA-DNA杂交结果表明菌株F19和B17分别为海细菌属和海杆菌属的一个新种。
　　 2.分别测定了菌株F2、F19、B17和US6-1对菲、芘的降解能力，并采用均匀设计方法优化了菌株US6-1对芘、荧蒽和苯并[a]芘等高分子量PAHs的降解条件。优化后，US6-1对芘、荧蒽和苯并[a]芘的降解能力分别达到了6.46 mg L-1d-1、6.86 mg L-1 d-1和4.74 mg L-1 d-1。这是首次将均匀设计方法运用于海洋细菌PAHs降解条件优化的研究报道。
　　 3.运用双向电泳技术(2-DE)比较分析了Novosphingobium sp.F2在菲、芘诱导下蛋白表达图谱，从中获得在芘诱导24h后表达量上升的12个蛋白，以及在菲诱导24 h后增量表达的11个蛋白，经MALDI-TOF-TOF-MS鉴定获得包括单加氧酶、双加氧酶，脱氢酶、脱羧酶等参与PAHs代谢的关键酶，以及调控其它生理代谢过程的蛋白。
　　 4.以蛋白鉴定结果为依据，成功克隆得到PAHs降解代谢过程中起关键作用的酶环羟基化双加氧酶(RHD)和邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)的编码基因。经序列分析，该C23O基因为尚未报道过的新基因，并实现了C23O基因在宿主E.coli BL21(DE3)中的表达。
　　 5.利用实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)从转录水平上分析了RHD基因和C23O基因在菲、芘和苯并[a]芘诱导下的表达，结果表明菲和苯并[a]芘可以促进两基因的表达，而芘则抑制其表达。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．多环芳烃(PAHs)在环境的分布与危害

1．1 PAHs简介

1．2 PAHs的来源与分布

1．3 PAHs的危害

2．PAHs污染环境的微生物修复

2．1 PAHs环境中的归宿

2．2 PAHs的生物修复

2．3 PAHs降解微生物

3．PAHs微生物降解机制研究

3．1 酶学研究进展

3．2 基因组学研究进展

3．3 转录组学研究进展

3．4 蛋白组学研究进展

3．5 代谢组学研究进展

4．本论文研究的内容与意义

第二章 多环芳烃降解菌的筛选与鉴定

1．材料与方法

1．1 样品来源

1．2 主要材料

1．3 主要方法

2．结果与分析

2．1 驯化过程中ETSA测定

2．2 改良的平板升华法筛选PAHs降解菌

2．3 降解菌的BOX-PCR分析

2．4 PAHs降解菌的形态特征

2．5 降解菌的16S rRNA基因系统发育分析

2．6 DNA-DNA杂交结果

2．7 最适生长条件测定

2．8 API细菌鉴定系统鉴定结果

2．9 抗生素敏感性测定

2．10 菌株与同属近源模式种之间特征比对

2．11 脂肪酸组成测定

2．12 磷脂种类测定

3．讨论

3．1 多环芳烃降解菌的筛选

3．2 多环芳烃降解菌的鉴定

4．小结

第三章 降解菌对PAHs降解条件优化

1．材料与方法

1．1 实验菌株

1．2 主要材料

1．3 基本方法

2．结果与分析

2．1 PAHs诱导下菌株US6-1的C23O活力测定

2．2 降解菌对菲和芘的降解能力测定

2．3 不同处理条件下菌株US6-1对HMW-PAHs的降解

2．4 芘、荧葸及苯并[a]芘降解力模型的构建及降解潜力的预测

2．5 降解潜力的检验

3．讨论

3．1 菌株US6-1对菲、芘的降解能力评价

3．2 菌株US6-1的降解条件优化

4．小结

第四章 新鞘氨醇菌对PAHs降解机制研究

1．材料与方法

1．1 实验菌株

1．2 实验材料

1．3 基本方法

2．结果与分析

2．1 菌株F2在PAHs诱导下C23O酶活测定

2．2 菌株F2在PAHs诱导下ETSA酶活测定

2．2 超声破碎参数的优化

2．3 蛋白载样量对双向电泳分离效果的影响

2．4 聚焦伏时数对双向电泳的影响

2．5 不同蛋白提取缓冲液对双向电泳的影响

2．6 PAHs诱导下菌株F2的蛋白差异表达分析

2．7 差异蛋白点的MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定

2．8 质粒DNA的提取

2．9 PAHs降解关键酶基因的克隆

2．10 关键酶基因的序列分析

2．11 C23O基因表达载体的构建

2．12 降解过程中降解关键醛因在转录水平的调控

3．讨论

3．1 适用于新鞘氨酵菌PAHs代谢机制研究的双向电泳分析平台的建立

3．2 菌株F2在PAHs诱导下的C23O酶活变化

3．3 菌株F2参与PAHs代谢的蛋白

3．4 细菌的PAHs代谢途径

3．5 降解关键酶基因转录水平的调控

4．小结

第五章 结论与展望

1．结论

2．主要创新点

3．展望

参考文献

附录

硕博连读期间参与课题

发表和待发表的学术论文

缩略语对照表

致谢