骨细胞与生物材料相互作用的生物芯片和原位物理化学研究

摘要

现代微系统技术及各种原位物理化学方法,为生物表面/界面的研究提供了前所未有的机遇和全新的研究层次。本工作致力于应用发展的微流控和微电极阵列(MEA)生物芯片、原子力显微镜(AFM)、电化学阻抗谱(EIS)和衰减全反射傅立叶红外光谱(ATR-FTIR)等先进技术,从不同的侧面和层次研究骨细胞与生物材料相互作用过程及机制。
　　主要研究内容有:
　　(a)建立昆明小鼠的原代颅骨成骨细胞和长骨骨髓基质干细胞(rMSCs)的培养,并应用于新型复合生物材料的研究;
　　(b)考察微流控生物芯片中流体状态(静止和流动)对人类骨髓基质干细胞(hMSCs)成骨分化的影响;
　　(c)应用微加工技术制备微图案化的表面薄膜,应用AFM原位表征微图案化表面的活成骨细胞三维形态,控制不同表面细胞的生长、黏附和形态;
　　(d)设计并制作钛微电极阵列芯片及其细胞培养的原位EIS监控电解池,并进一步高通量地研究复合生物材料表面与细胞的相互作用;
　　(e)提出一种MG63活细胞的实时ATR-FTIR监控的新方法,并用来研究细胞与TiO2及羟基磷灰石(HA)材料表面的相互作用。
　　主要研究结果如下:
　　1.细胞培养实验结果显示:羟基磷灰石/碳纳米管(HA/MWCNTs)复合材料具有良好的生物相容性;电化学制备的磷酸八钙/蛋白质(OCP/protein)复合膜层可显著增强成骨细胞的黏附与生长。
　　2.在两种微流体状态中,细胞可存活数周,但显示不同的增殖和分化行为。在液压控制的流动培养室中,细胞快速生长,但液压产生的液体流动不利于钙节结的形成。在初始细胞密度(2×104～4×104cells/cm2)下,液槽控制的静态培养室中细胞形态和茜素红染色图显示了最佳的成骨分化效果。
　　3.厚度为100～200nm的微图案表面可对活细胞局部三维形态进行选择性地控制:当细胞厚度和微图案高度比值小于3.2时,细胞表面能根据基底显示相应的微图案形态;当二者比值在3.9～7.8之间时,细胞表面不会显示基底的微图案形貌;有效控制金属薄膜厚度为20～30nm,可产生具有良好透光性和导电性的医用金属表面,便于进一步开展实时的电化学和光学显微联合监控工作;单独的Ag薄膜对细胞具有毒性并且无法在其表面进行HA的电化学沉积;应用电化学沉积和光刻技术,可制作微图案化的Cr-Ag-HA薄层,rMSCs可在Cr-Ag和Cr-Ag-HA薄膜表面生长;应用微接触印刷术(μCP)在钛膜层表面制备了高分子图案钛-聚赖氨酸-聚乙二醇(Ti-PLL-PEG),可控制rMSCs的黏附和生长。
　　4.采用多通道电流控制的选择性电化学沉积方法,可将Ag、HA和Ag-HA涂层集成于同一钛MEA芯片上;对比钛微电极阵列表面的不同涂层与活细胞相互作用的EIS,并应用等效电路Rmed(Rox Qox)(Rpro Qpro)(Rcell Qcell)进行拟合;涂层和细胞增殖对Ti和溶液的界面的电化学行为具有一定的影响;Rcell元件数值与涂层的生物相容性和细胞增殖具有一定的关联;根据Rcell元件数值判断生物相容性的顺序如下:Ti-Ag-HA＞Ti-HA＞Ti-Ag＞Ti。
　　5.由于水和培养基的强红外吸收谱峰会干扰活细胞全谱的获得,本论文通过原位光谱背景扣除法,获得活细胞的红外吸收光谱变化信息,在1370～2000和3500～3940cm-1出现一系列重现性良好的向下红外谱峰;相比于Ge和Ge-TiO2,Ge-HA与细胞有强的相互作用,产生一个归属于P-O不对称伸缩振动的位于1016～1079cm-1的红外吸收峰,在分子水平说明HA具有更好的生物活性。