蛋白质组学技术研究甲基对硫磷胁迫下扇贝消化和肾组织的差异表达蛋白质

摘要

甲基对硫磷(methyl parathion,MP)是我国生产和使用量最大的有机磷农药(OPP)之一,影响范围广,毒性高,是极具代表性的有机磷污染物。MP的过量使用,已对水生生物的生存乃至人类健康构成了一定威胁。目前,对于OPP的毒性机制研究还主要侧重于对少数几种酶的研究,研究方法更多还是采用传统的终点法,而在蛋白质组水平上进行OPP毒理学研究的报道还相对较少。本论文以虾夷扇贝为研究对象,以急性和慢性浓度的MP为途径胁迫扇贝,研究其肾组织和消化腺的差异表达蛋白质。
　　 为了建立急性和慢性MP胁迫的分析模型,我们对96h半致死浓度(LC50)、扇贝的SOD活性、AchE活性以及MP残留等传统指标进行了测定。Bliss法计算得到的96h LC50为4.59 mg/L。而在1 mg/L和50μg/L的MP浓度下,扇贝肾组织和消化腺中都有明显的MP蓄积现象,蓄积程度随暴露时间延长而增加。此外,在1 mg/L MP浓度下,肌肉中AchE活性受到了明显的抑制,而肾组织和消化腺中的SOD活性则呈现“先上升后下降”的趋势。在此基础上,我们选用1mg/L,48 h和2.5mg/L,48 h作为MP急性胁迫下蛋白质组学研究的两个端点,而选用50μg/L,14 d和50μg/L21 d作为MP慢性胁迫的两个端点。运用常规蛋白质组学和膜蛋白质组学方法,我们在肾组织和消化腺中共筛选和鉴定了79个差异蛋白。在急性MP胁迫下肾组织中筛选了26个差异蛋白,其中有12个蛋白下调,10个蛋白上调;在慢性MP胁迫下肾组织中有17个差异蛋白,其中有8个下调,7个上调;而在慢性MP胁迫下消化腺中有36个差异蛋白,其中有7个下调,17个上调。运用生物信息学方法预测差异蛋白的跨膜结构域(TMR)、疏水性(GRAVY)和细胞定位,结果表明,这些差异蛋白有很多是胞浆蛋白,而真正的膜内在蛋白并不多。我们从上述三组双向电泳数据中共选择了38种差异蛋白,运用real-time PCR方法对其表达水平进行分析,发现有些蛋白mRNA水平变化趋势与双向电泳所显示的实验结果相似,而有些蛋白却表现出相反的结果。进一步用Western blotting分析其中两个蛋白-β-MPP和α-tubulin的表达水平,发现β-MPP的表达变化与双向电泳一致;而α-tubulin在不同的细胞亚组分中却呈现出不同的蛋白丰度。以上结果表明,有些差异蛋白在细胞中可能受到不同方式的调控,导致蛋白的转录水平和蛋白丰度的变化呈现出不一致性。
　　 对差异蛋白的功能分析表明,这些蛋白涉及了包括氧化应激、线粒体功能、细胞骨架动力学、细胞适应、信号转导、细胞周期、蛋白合成、物质代谢、渗透平衡、内分泌系统、免疫等多种细胞生理功能,这说明MP对细胞的毒性作用机制是及其复杂的。
　　 由于MPP在进化中的高保守性和在上述实验中表现出的可信度,我们认为MPP可能成为一种潜在的能够监测OPP污染的生物标志物。我们运用RACEPCR技术扩增出MPP beta亚基的全长cDNA序列,并用MEGA4.0软件构建一个简单的MPP系统进化树。结果证实,MPP在真核生物,尤其是脊椎动物中具有很高的保守性。以上结果有助于进一步深入探索MP的毒理机制,并为MPP作为监测OPP环境污染的生物标志物提供了提供了实验依据。