GluA1蛋白氨基末端结构域的晶体结构及iGluR潜在配体的筛选

摘要

离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptors,iGluRs)是一种跨膜的阳离子通透性配体门控型离子通道,是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中兴奋性神经传递的主要介导者。iGluR家族中的α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionie acid receptors,AMPARs)主要介导快速兴奋性神经传递,表达并维持长时程增强效应(10ng-termpotentiation,ITP),是学习和记忆的基本元件。AMPAR的功能障碍与许多神经性疾病的发生有关。AMPAR也因此成为治疗这些疾病的重要靶点之一。本论文解析了GluA1蛋白氨基末端结构域的晶体结构,并运用荧光热稳定性检测技术筛选iGluR的潜在配体。下面分两部分来讲述:
　　第一部分: GluA1蛋白氨基末端结构域的晶体结构
　　与其他iGluR成员一样,AMPAR只能特异性地与本亚家族受体的亚基组装成四聚体离子通道。一般认为,这一组装过程是由位于胞外的氨基末端结构域(amino-terminal domain,ATD)介导的。然而,ATD如何驱动这些亚基的组装仍是一个亟待解决的问题。除了参与受体的组装之外,ATD还与突触发生、受体转运以及跨突触信号传导等过程有关,但其确切机制目前尚不清楚。通过对ATD结构的解析,有助于我们更深入地了解其生理功能。
　　在本研究中,我们解析了分辨率为2.5 A的GluAl-ATD蛋白晶体结构。经过详细的结构分析,我们发现AMPAR-ATD的同二聚化主要是由高度保守的L1结构域间相互作用来介导的,其L2结构域则具有相对较高的柔性。我们推测各个AMPAR-ATD在同二聚化亲和力方面的差异可能与它们在L2结构域柔性上的差异有关。虽然GluA1和GluA2的二聚体内作用界面是高度相似的,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)实验,我们观察到了他们之间可形成较弱的异二聚体。综合这些数据,我们推测AMPAR-ATD本身可能不足以驱动异聚体的装配。亦即,除了ATD之外,配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD)和跨膜结构域(transmembrane domains,TMD)可能也同样参与了AMPAR的异聚体组装过程。另外,通过对GluA1-ATD的晶格分析,我们发现了一个全新的、位于两对二聚体之间的作用界面。这个界面与以往已知的“二聚体的二聚体”式ATD界面有很大的不同:在这个新界面中,两对ATD二聚体由L1结构域介导形成“头对头”式的排列,其埋藏面积达到1900 A2,且这种全新的排列方式主要是由S-loop介导的。由于S-loop具有亚家族特异性,这种“头对头”式的组装,可能是引导iGluR同亚家族亚基进行选择性组装的关键决定步骤。这一独特的AMPAR四聚体集合方式同时也暗示了在突触膜处高浓度的AMPAR是如何簇集的,并从结构生物学角度证明了ATD参与跨突触信号转导的可能性。
　　第二部分:运用荧光热稳定性检测技术筛选iGluR的潜在配体
　　以蛋白质结构为基础的药物设计是当今新药研发的重要手段,也是未来药物开发的主要趋势之一。我们以GluA2-ATD蛋白的晶体结构为基础,通过虚拟文库筛选(virtual library screening,VLS),找到了65个候选化合物。运用荧光热稳定性检测方法(ThermalFluor assay)对这65个化合物进行了初步鉴定,未发现能显著改变GluA2-ATD蛋白熔点(melting temperature,TM)的化合物。目前我们正尝试用电生理学方法对这些化合物进行重新检验。
　　针对NMDA型谷氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)的药物的副作用一直是困扰患者、医生以及研究者的重要问题。GluN3作为NMDAR家族中最独特的成员,自然也成了新药开发的重点对象。我们通过ThermalFluor方法,发现在有/无配体存在的情况下,不论GluN1-LBD还是GluN3A-LBD的TM值都显示出了巨大的差异,初步证明了运用该方法进行GluN3A配体的高通量筛选的可行性。目前我们已与强生公司建立了合作伙伴关系,运用ThermalFluor方法对靶向GluN3A-LBD的先导化合物进行高通量筛选。