HSG基因调控COPD大鼠气道Wnt/Ca2+信号通路及Wnt5a基因与COPD急性加重期患者中医证型相关性研究

摘要

本文从以下两部分进行了阐述：
　　第一部分 HSG基因调控COPD大鼠气道组织Wnt/Ca2+信号通路
　　目的：
　　(1).通过检测慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)模型大鼠气道组织中Wnt5a基因及蛋白表达，并观察其与基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、血小板衍生生长因子(Platelet DerivedGrowth Factor， PDGF)、转化生长因子β1(Transforming Growth Factor Beta，TGF-β1)等致COPD气道重塑的主要因子相关性，探讨Wnt/Ca2+信号通路在COPD气道重塑中所起的作用，及其作用机制。(2).通过检测COPD模型大鼠气道组织中细胞增殖抑制基因(Hyperplasia Suppressor Gene，HSG)基因及蛋白表达量，并观察其与Wnt5a的相关性，从而探讨其是否通过调控Wnt/Ca2+信号通路参与COPD气道重塑。
　　方法：
　　随机将30只SPF级健康雄性SD大鼠(鼠龄为6周，体重约100±5g)随机分为COPD模型组18只，正常组12只;运用脂多糖加烟熏方法建立COPD大鼠模型。造模成功后取出两组大鼠肺组织，刮除肺泡及结缔组织。运用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-PCR)技术检测COPD模型大鼠气道组织中HSG、Wnt5a、MMP-9、PDGF、TGF-β1基因表达量。运用蛋白印迹法(Western Blot，WB)技术检测COPD模型大鼠气道组织中HSG、Wnt5a蛋白表达量。运用酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技术检测COPD模型大鼠气道组织中MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白表达量。分析Wnt5a与MMP-9、TGF-β1、PDGF的相关性，分析HSG与Wnt5a相关性，P＜0.05即具有统计学意义，P＜0.01即具有显著统计学意义。
　　结果：
　　(1).COPD模型大鼠气道组织中HSG基因表达量为0.387±0.06低于正常组（1±0.05），COPD大鼠气道组织中HSG蛋白表达量为0.231±0.04低于正常组（0.680±0.02），P＜0.01，具有显著统计学意义。(2).COPD模型大鼠气道组织中Wnt5a、MMP-9、TGF-β1、PDGF基因表达量分别为1.6±0.32、1.960±0.04、1.968±0.02、2.039±0.06均高于正常组（1.0±0.05），COPD大鼠气道组织中Wnt5a、MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白表达量分别为0.587±0.06、107.282±1.24、81.586±0.66、29.79±0.07均高于正常组，P＜0.01，具有统计学意义。(3).COPD大鼠气道组织中Wnt5a基因与MMP-9、TGF-β1、PDGF基因呈正相关，r值分别为0.550、0.518、0.618，P＜0.05，具有统计学意义;COPD大鼠气道组织中WntSa蛋白与MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白呈正相关关系，r值分别为0.567、0.582、0.599，P＜0.05，具有统计学意义。(4).COPD大鼠气道组织中HSG基因与Wnt5a、MMP-9、TGF-β1、PDGF基因呈负相关，r值分别为-0.625、-0.515、-0.579、-0.742，P＜0.05，具有统计学意义;COPD大鼠气道组织中HSG蛋白与WntSa、MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白呈负相关，r值分别为-0.750、-0.634、-0.859、-0.557，P＜0.05，具有统计学意义。
　　结论：
　　1.COPD大鼠气道组织中Wnt5a、MMP-9、TGF-β1、PDGF基因及蛋白表达量表均高于正常组;COPD大鼠气道组织中HSG基因及蛋白表达量低于正常组。
　　2.COPD大鼠气道组织中Wnt5a与MMP-9、TGF-β1、PDGF基因及蛋白表达存在正相关，因此可推断出Wnt/Ca2+信号通路可上调MMP-9、PDGF、TGF-β1，促进COPD大鼠气道重塑。
　　3.COPD大鼠气道组织HSG与MMP-9、TGF-β1、PDGF、Wnt5a表达之间存在负相关，因此可推断HSG可通过调控Wnt/Ca2+信号通路影响MMP-9、PDGF、TGF-β1，从而干预COPD大鼠气道重塑。
　　第二部分 Wnt5a与COPD急性加重期患者中医证型的相关性研究
　　目的:
　　通过检测慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation ofchronicobstructive pulmonary disease，AECOPD)患者血液中的Wnt5a基因表达量，比较AECOPD患者不同中医证型血液中Wnt5a基因表达量差异，尝试探讨Wnt5a基因与AECOPD部分中医相关证型的关系，尝试为COPD中医证型诊断提供客观标准。
　　方法:
　　收集慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者45例，参考按普通高等教育“十一五”规划教材，田德禄主编的《中医内科学》肺胀证型诊断标准，将慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者分为痰浊壅肺证、痰热郁肺证、肺肾气虚证三个组;患者入院时同步进行肺功能检测及抽取静脉血，运用RT-PCR检测AECOPD各中医证型患者血液中Wnt5a的表达量，并选取15例健康人作为对照组进行对比观察。
　　结果:
　　痰浊壅肺组、痰热郁肺组、肺肾气虚组AECOPD患者血液中Wnt5a基因表达量分别为1.45±0.54、1.70±0.71、2.11±0.92，均高于正常组（1±0.05），P＜0.01，具有显著统计学意义;三组证型间Wnt5a基因表达量:痰浊壅肺＜痰热郁肺＜肺肾气虚(P＜0.01)，具有显著统计学意义。
　　结论:
　　Wnt/Ca2+信号通路中Wnt5a基因的相对表达量在三组中医证型中存在显著差异，且都高于正常组，其中肺肾气虚证AECOPD患者外周血中Wnt5a升高尤为明显。能为AECOPD中医证型诊断提供一定的客观标准。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 HSG基因调控COPD大鼠气道组织Wnt／Ca2+信号通路

1．实验材料

2．实验方法

2．1 COPD大鼠模型建立

2．2模型鉴定

2．3大鼠气道组织采集及储存

2．4 RT-PCR检测大鼠气道组织中HSG、Wnt5a、MMP-9、PDGF、TGF-β1基因表达

2．5 Western Blot检测大鼠气道组织中HSG、Wnt5a蛋白表达量

2．6 ELISA法检测大鼠气道组织组织中MMP-9、PDGF、TGF-β1蛋白表达

2．7实验技术质量控制

3．统计方法

4．结果

4．1 COPD大鼠模型建立结果

4．2 RT-PCR检测结果

4．3 COPD模型大鼠气道组织中HSG、Wnt5a表达量及相关性分析

4．4 ELISA检测COPD模型大鼠气道组织中MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白表达

4．5 HSG基因与Wnt5a、MMP-9、TGF-β1、PDGF基因相关性分析

4．6 Wnt5a基因与MMP-9、TGF-β1、PDGF基因相关系数表

4．7 HSG与MMP-9、TGF-β1、PDGF、Wnt5a蛋白相关性分析

4．8 Wnt5a与MMP-9、TGF-β1、PDGF蛋白相关性分析

第二部分 Wnt5a基因与COPD急性加重期患者中医证型相关性研究

1．研究资料

1．1研究对象

1．2诊断标准

1．3纳入标准

1．4排除标准

1．5剔除标准

1．6病例质量控制

1．7实验分组

1．8实验主要试剂及设备

1．9实验试剂配置

2．实验方法

2．1临床检查及血液样本采集

2．2血总RNA提取

2．3 RNA质量、浓度及纯度测定

2．4 cDNA合成

2．5 Real-Time PCR扩增反应

3．数据统计方法

4．1基本情况

4．2不同证型血液总RNA完整性检测

4．3 Wnt5a基因扩增曲线图及其mRNA相对表达量情况

讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢

个人简历