海绵和海鞘中可培养放线菌多样性的比较研究

摘要

放线菌是一类具有重要工业价值的细菌，目前约70％的抗生素类化合物都生产自放线菌。海绵能够产生大量具有药用价值的天然活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生理活性。其中很多活性物质由海绵相关微生物产生，这些微生物占海绵干重的40-70％，且种类繁多。对海绵相关微生物的大规模培养可以解决海绵药源供给不足的问题。海鞘中含有许多重要的生物活性物质，是除海绵以外人类获取药用天然产物的重要资源。但其相关微生物的研究报道很有限，极少涉及相关放线菌的多样性。因此，在活跃的海绵相关放线菌多样性的研究状态下，对海鞘相关放线菌多样性的研究是一项具有重要意义的课题。
　　 本文采用5种放线菌分离培养基和1种细菌通用培养基，在相同的分离培养条件下，对采集于地域差别较大的福建海域山海绵（Mycale sp.）、网架海绵(Stylisssp.)和海南海域皱瘤海鞘（Styela plicata）和乳突皮海鞘（Molgula manhattensis）中可培养放线菌进行分离，采用16S rDNA限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，RFLP)分析和序列分析，比较其多样性的差异。获得的多样性结果为分离出新颖放线菌，筛选具有活性的特殊菌株提供了重要的参考资料。具体研究结果如下:
　　 用所选的6种培养基成功获得了丰富的微生物资源。共分离放线菌198株，其中从山海绵中分离得到51株，网架海绵36株;从皱瘤海鞘中分离得到80株，乳突皮海鞘31株。海绵和海鞘在培养基M2中分离出最多的放线菌。
　　 多样性分析采用RFLP结合16S rDNA测序的方法，获得38个放线菌RFLP图谱类型。比较两种采集于中国福建海域的两种海绵（山海绵和网架海绵）相关放线菌多样性的差异，菌株的测序分析表明，山海绵中分离得到的放线菌包括链霉菌、拟诺卡氏菌、节细菌、戈登菌和细杆菌，共5个属。从网架海绵中分离到链霉菌和短杆菌2个属，链霉菌属具有显著优势。与首次被研究的网架海绵相关放线菌多样性水平相比，山海绵中分离得到的放线菌不但数量明显多于网架海绵，在种属分布上也更广泛。海绵来源的放线菌中有4株菌的16S rDNA序列与最相近的菌株相似性低于97％，可能是潜在的新菌株。
　　 而比较两种采集于中国海南海域的两种海鞘（皱瘤海鞘和乳突皮海鞘）之间相关放线菌多样性，从皱瘤海鞘中分离出6个放线菌属:链霉菌、拟诺卡氏菌、戈登菌、细杆菌、短杆菌和红球菌。从乳突皮海鞘中分离出优势菌属链霉菌属和小单孢菌属。皱瘤海鞘中分离得到的放线菌多样性明显高于乳突皮海鞘，并且差异显著。海鞘来源的放线菌有8株为潜在新菌株。
　　 海鞘与海绵相比，虽然放线菌多样性在数量上和种类上存在显著差异，但两者相关放线菌多样性水平相当，从海绵中分离到的放线菌，除节细菌（Arthrobacter）以外，均包括在海鞘分离的放线菌属中。并且从皱瘤海鞘中分离到目前为止多样性最高的放线菌资源，初步证明海鞘中不容忽视的相关放线菌多样性水平，是除海绵之外另一获得放线菌新资源以及药用天然活性产物的重要来源。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 引言

1．2 海绵及相关微生物

1．2．1 海绵简介

1．2．2 海绵相关微生物多样性

1．2．3 海绵与其共生微生物间的关系

1．2．4 海绵及其相关微生物中的活性产物

1．3 海鞘及相关微生物

1．3．1 海鞘简介

1．3．2 海鞘相关微生物多样性的研究

1．3．3 海鞘中活性产物的研究

1．4 海绵和海鞘相关放线菌的多样性

1．5 海洋微生物多样性研究方法

1．5．1 培养分离方法在海洋微生物多样性研究中的应用

1．5．2 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用

1．5．3 分子方法和分离培养方法相结合的应用

1．5．4 海绵相关放线菌多样性研究方法进展

1．6 研究意义与目的

1．6．1 研究意义

1．6．2 研究目的

第2章 海绵和海鞘中放线菌的分离

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 海绵中放线菌的分离

2．3．2 海鞘中放线菌的分离

2．4 讨论

2．4．1 海绵相关微生物分离培养基的比较

2．4．2 海鞘相关微生物分离培养基的比较

2．4．3 海绵和海鞘相关微生物分离情况的共性和特异性比较

2．5 小结

第3章 海绵中可培养放线菌的多样性研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果

3．3．1 放线菌基因组DNA提取

3．3．2 16S rDNA的PCR反应结果

3．3．3 适于目标菌株16S rDNA RFLP限制型内切酶的筛选

3．3．4 RFLP结果

3．3．5 海绵相关微生物16S rDNA的序列分析

3．4 讨论

3．4．1 RFLP分析中限制性内切酶的选择

3．4．2 分离菌株的16S rDNA的序列分析

3．4．3 海绵中可培养微生物多样性异同比较

3．5 小结

第4章 海鞘中可培养放线菌的多样性研究

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果

4．3．1 放线菌基因组DNA提取

4．3．2 16S rDNA的PCR反应结果

4．3．3 适于目标菌株16S rDNA RFLP限制型内切酶的筛选

4．3．4 RFLP结果

4．3．5 海鞘相关微生物16S rDNA的序列分析

4．4 讨论

4．4．1 分离菌株的16S rDNA的序列分析

4．4．2 海鞘中可培养微生物多样性异同比较

4．4．3 海鞘中高的放线菌多样性

4．4．4 海绵与海鞘相关放线菌多样性比较

4．4．5 海绵和海鞘相关放线菌多样性差异产生原因探讨

4．5 小结

第5章 总结与研究展望

5．1 总结

5．1．1 实验结论

5．1．2 研究价值

5．1．3 不足

5．2 研究展望

参考文献

作者简介

致谢