Wnt信号--HNF4a双负反馈环调控肝细胞肝癌上皮--间质转化过程的机制研究

摘要

实验背景及研究目的:Wnt信号通路参与多种癌症的EMT进程，然而，其在肝细胞癌(HCC) EMT过程中的作用及其相关调控机理一直未被深入研究。肝细胞核因子HNF4α是组织特异性转录因子，参与调控肝脏早期发育、决定肝细胞分化、维持肝细胞正常上皮形态、调控肝脏特异基因的表达、维持肝脏正常功能，也参与肝细胞EMT进程。然而HNF4α维持肝细胞分化状态、参与肝癌细胞EMT进程的分子机理一直未被清楚阐述。在这篇文章中，我们致力于探究Wnt信号通路及HNF4α参与调控肝细胞癌EMT进程的分子机理及Wnt信号通路与HNF4α之间的相互作用。 实验方法:荧光定量PCR及western实验用于分析相关基因的表达;免疫共沉淀实验用于证明蛋白-蛋白相互作用;免疫荧光、划痕试验及侵袭实验用于展示EMT相关表型;DEN诱导的大鼠肝癌模型用于进行体内试验，探究体内HNF4α与Wnt信号通路之间的相互调控。 结果:在本篇论文中，我们首次提出在肝癌EMT进展过程中，Wnt信号通路负调控HNF4α。我们证明了Wnt信号通路对HNF4α的抑制是通过Snail、Slug完成的，Snail和Slug可以直接结合在HNF4α启动子区域的E-box上来负调控HNF4α;更进一步的，我们揭示了，HNF4α可以通过与β-catenin竞争性的结合TCF4来抑制Wnt信号通路活性;与此同时，HNF4α还可以促进转录抑制因子在Wnt信号通路靶基因启动子上的结合以及β-catenin的膜定位。最后，我们运用大鼠肝癌模型，在体内证明了HNF4α与Wnt信号通路之间的相互调控可以影响大鼠肝癌EMT过程。 HNF4α高表达时，HNF4α与TCF4形成复合体，使得β-catenin的转录激活活性下调，抑制了EMT调控因子Snail、Slug的表达。在此情况下，肝肿瘤细胞倾向于维持上皮细胞形态及特性;在Wnt信号通路被异常激活后，TCF4主要与β-catenin形成复合体，激活Snail、Slug的表达，触发EMT过程，促使细胞向间质状态转化，推动肿瘤的迁移及侵袭。 结论:综上所述，本论文中，我们证明了Wnt信号通路和HNF4α之间存在着双向负反馈调节环，揭示了此双向负反馈调节环在肝细胞癌EMT进展中的作用及调控机理。这也为抑制肝细胞癌进展提供了理论基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 EMT与肿瘤进展

1．1．1 EMT的概念

1．1．2 EMT对于生物体的重要作用

1．1．3 EMT的三种类型

1．1．4 EMT与癌症进展和转移的关系

1．1．5 EMT过程的诱导与调控

1．2 肝细胞核因子调控网络(HNFs)

1．2．1 HNFs的主要成员

1．2．2 HNFs主要组分的相互调控

1．2．3 HNF4α在肝脏中的重要作用

1．3 Wnt信号通路概述

1．3．1 经典Wnt信号通路

1．3．2 Wnt经典信号通路和肿瘤

第二章 材料与方法

2．1 常用的药品和试剂

2．2 相关实验方法

2．2．1 慢病毒干扰质粒的构建

2．2．2 细胞培养相关方法

2．2．3 大鼠相关实验方法

第三章 实验结果

3．1 Wnt信号通路参与肝癌细胞EMT过程

3．1．1 MHCC-97h细胞中间质与上皮细胞标记物的表达与Wnt信号通路活性相关

3．1．2 Wnt信号通路活性影响MHCC-97h细胞的迁移、侵袭能力

3．1．3 Wnt信号通路影响EMT过程相关蛋白的表达水平

3．2 Wnt信号通路通过Snail和Slug负调控HNF4α

3．2．1 Snail，Slug抑制HNF4α的表达

3．2．2 Snail，Slug对HNF4α的抑制是通过其启动子上的E-box起作用的

3．2．3 Wnt信号通路对HNF4α的抑制是通过Snail，Slug起作用的

3．3 在肝癌细胞中，HNF4α抑制Wnt信号通路活性

3．3．1 HNF4α抑制Wnt信号通路的活性

3．3．2 HNF4α不影响β-catenin的转录，也不影响其蛋白稳定性

3．3．3 HNF4α在β-catenin的下游抑制Wnt信号通路活性

3．4 体内实验中HNF4α与TCF4直接结合

3．4．1 HNF4α与TCF4结合，但不与β-catenin结合

3．4．2 TCF4蛋白的β-catenin结合域对于HNF4α与TCF4的结合是必须的

3．4．3 HNF4α通过其N-端结构域与TCF4直接结合

3．4．4在体内HNF4α与TCF4结合，但不与β-catenin结合

3．5 HNF4α与β-catenin竞争结合TCF4，同时募集转录抑制因子来抑制EMT相关的Wnt信号通路靶基因的转录

3．5．1 HNF4α与β-catenin之间存在竞争关系

3．5．2 HNF4α影响β-catenin在Wnt信号通路靶基因启动子区域的结合，且HNF4α可以促进转录抑制因子结合到wnt信号通路靶基因的启动子区域

3．5．3 HNF4α可以抑制Wnt信号靶基因的转录

3．6 HNF4α可以调控β-catenin在细胞黏附和转录激活两种功能之间的转换

3．7 HNF4α和Wnt信号通路之间的相互作用影响肝癌细胞中EMT过程

3．7．1 HNF4α会逆转Wnt信号通路诱发的EMT调控因子表达水平的上调

3．7．2 HNF4α可以逆转Wnt信号通路诱发的EMT表型

3．8 HNF4α与Wnt信号通路之间双向负反馈调节环的体内实验

3．8．1 大鼠肝癌进展过程中β-catenin蛋白水平上调，HNF4α表达水平下调

3．8．2 在体内抑制wnt信号通路活性后HNF4α表达水平上调

3．8．3 体内HNF4α表达水平上调会抑制Wnt信号通路活性，同时可促进β-catenin的膜定位

3．8．4 体内过表达dnTCF4或者HNF4α都可以上调E-cad，下调Vimentin

四讨论

参考文献

致谢