非诺贝特对翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用及机制的初步探索

摘要

翼状胬肉是一种眼表常见疾病，发病率高，具有慢性增殖性。发病后，局部结膜及其下的纤维组织变性增生，逐渐侵入角膜，严重时可覆盖瞳孔造成失明。临床以手术切除为主，联合羊膜移植、自体角膜缘干细胞移植、抑制增殖眼药水合用等可有效减少复发率。目前与翼状胬肉发病机制有关的学说很多，但尚无定论。但大量流行病学的调查发现过量紫外线的照射是导致翼状胬肉发病的重要因素，进一步的研究则发现翼状胬肉常伴有DNA氧化产物的产生以及炎性因子炎症细胞的聚集。因此，目前多数学者认为翼状胬肉的发病机制与紫外照射引起的氧化应激和炎症反应有关。
　　 有研究发现，胬肉中存在氧化应激和炎症反应在。在氧化应激中，NOX4和Nrf2是比较重要的两种物质。前者是NADPH氧化酶中的一种，对ROS的产生起主要作用;而Nrf2被激活后可发挥抗氧化活性，对ROS的清除有重要意义。在炎症中，致炎因子IL6和TNFα则处于主要地位，并且已有研究证实翼状胬肉组织中有二者的存在。
　　 非诺贝特是PPARα激动剂，研究发现PPARα被激活后可发挥抗炎抗氧化的作用，最近研究发现非诺贝特可有效治疗糖尿病性视网膜疾病。非诺贝特可能用于其他眼表疾病，如翼状胬肉的治疗。本课题探索非诺贝特对翼状胬肉细胞的抑制作用以及机理。
　　 在实验中，我们首先利用翼状胬肉组织培养原代成纤维细胞(PFCs)，并给予非诺贝特观察其作用效果。结果发现，非诺贝特可有效抑制翼状胬肉原代成纤维细胞的增殖和迁移，并呈剂量效应关系。非诺贝特具有抗炎和抗氧化作用，其机制为非诺贝特可以下调ROS生成的主要酶NOX4并上调抗氧化因子Nrf2，非诺贝特对主要致炎因子IL6和TNFα也有抑制作用。在对其作用机制的进一步研究中发现，我们发现非诺贝特可以特异性的激动PPARα受体。非诺贝特可以上调PPARα的蛋白表达水平， PPARα拮抗剂MK886可以阻断非诺贝特的相关作用。而且，非诺贝特对PPARα的作用表现为基因转录后调节，在基因水平并无变化。
　　 综上所述，我们首次发现了非诺贝特对翼状胬肉原代成纤维细胞有抑制增殖和迁移的作用;非诺贝特具有抗炎抗氧化作用;初步的机制探索表明非诺贝特的作用是通过激活PPARα实现的。本课题为探索新的翼状胬肉的治疗提供了研究方向和实验依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 翼状胬肉的流行病学调查

1．1．1 纬度

1．1．2 日照与紫外线

1．1．3 性别

1．1．4 年龄

1．1．5 其他眼表疾病

1．1．6 其他因素

1．2 翼状胬肉发病机制的研究现状

1．2．1 紫外线与翼状胬肉

1．2．2 基质金属蛋白酶

1．2．3 细胞因子与翼状胬肉

1．2．4 细胞凋亡与翼状胬肉

1．3 翼状胬肉的治疗

1．3．1 手术治疗

1．3．2 药物治疗

1．3．3 其他治疗方法

1．4 非诺贝特的应用研究

1．4．1 非诺贝特与PPARα

1．4．2 非诺贝特对细胞增殖迁移的作用

1．4．3 非诺贝特的抗氧化作用

1．4．4 非诺贝特的抗炎作用

1．5 课题研究意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要器材

2．1．2 主要试剂

2．1．4 常用试剂及培养基的配置方法

2．2 实验方法

2．2．1 翼状胬肉成纤维细胞的分离培养

2．2．2 蛋白印迹法

2．2．3 Real-time PCR

2．2．4 免疫荧光组织化学染色法

2．2．5 CCK8检测细胞增殖

2．2．6 细胞划痕实验

第三章 结果与分析

3．1 翼状胬肉原代成纤维细胞的分离培养

3．1．1 临床资料

3．1．2 翼状胬肉原代成纤维细胞培养结果

3．2 非诺贝特抑制翼状胬肉成纤维细胞的增殖迁移

3．2．1 细胞增殖实验结果

3．2．2 细胞划痕实验结果

3．3 非诺贝特下调翼状胬肉成纤维细胞的氧化应激和炎症水平

3．3．1 非诺贝特抗氧化应激研究结果

3．3．2 非诺贝特抗炎研究结果

3．4 非诺贝特对翼状胬肉成纤维细胞作用机制的初步探索

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢