高致病性H5N1型流感病毒非结构蛋白NS1的结构生物学研究

摘要

A型流感病毒是引起流行性感冒的主要病原体，具有高度变异性，能够感染人和多种动物，常常引起流感大流行，造成严重的损失和伤亡。而其中的H5N1亚型具有高致病性，能够跨种族传播，引起了全球的广泛关注与重视。A型流感病毒非结构蛋白NS1是其传播与感染过程中的重要毒力因子，在感染细胞中有高水平的表达，能够通过多种RNA-蛋白相互作用和蛋白-蛋白相互作用帮助病毒复制，阻止被感染细胞凋亡以及拮抗宿主的免疫系统进攻。
　　 NS1蛋白全长包含两个结构域，一个是N端的RNA结合区（RBD），NS1通过该结构域与病毒mRNA相互作用，调节病毒特异性蛋白的翻译，从而增强病毒的复制;另一个是C端的效应区(ED)，NS1通过该结构域和其他蛋白相互作用来阻断宿主(Ⅰ)型干扰素IFN的组装，抑制干扰素诱导蛋白的激活，从而逃避或拮抗宿主的免疫系统。同时，NS1蛋白能够与多种其他蛋白相互作用，参与细胞内多种信号通路的传导，如NS1能够与Crk家族蛋白相互作用激活PI3K信号通路。可以看出，NS1作为一种多功能调节蛋白，对流感病毒的毒性起着至关重要的作用。因此解析H5N1亚型NS1蛋白全长的晶体结构以及其与相互作用蛋白复合物的晶体结构对于我们进一步了解A型流感病毒的致病机制具有重要意义，为研究开发更有效的流感病毒抑制剂提供结构生物学依据。
　　 本课题中我们通过分子克隆技术，将NS1蛋白的全长野生型基因序列和突变型基因序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1和pET-28a中。采用原核表达系统重组表达可溶的目的蛋白，提取后采用亲和层析和凝胶排阻层析对目的蛋白进行纯化，获得高纯度高浓度的目的蛋白，最后通过蒸汽扩散法对目的蛋白进行结晶条件的初筛。同时，进行了NS1蛋白与CrkⅠ蛋白的相互作用复合物的纯化实验。

目录

声明

摘要

Contents

1 前言

1．1．流行性感冒概述

1．1．1．流感的历史

1．1．2．流感的危害与防治

1．2．流感病毒

1．2．1．流感病毒的概述

1．2．2．流感病毒的分类

1．2．3．流感病毒的变异特征

1．2．4．流感疫苗和抗流感药物

1．3．流感病毒非结构蛋白NS1

1．3．1．NS1蛋白概述

1．3．2．NS1蛋白RNA binding domam(RBD)

1．3．3．NS1蛋白Effector domain(ED)

1．3．4．NS1蛋白全长的结构研究

1．4．流感病毒非结构蛋白NS1的功能研究

1．4．1．NS1蛋白能够增强病毒的mRNA的翻译

1．4．2．NS1蛋白能够阻断细胞mRNA的成熟

1．4．3．NS1蛋白能够拮抗宿主免疫系统

1．4．4．NS1蛋白能够激活P13K信号通路

1．5．流感病毒非结构蛋白NS1与Crk家族蛋白相互作用

1．5．1．Crk家族蛋白

1．5．2．NS1蛋白与Crk家族蛋白相互作用

1．6．本课题的研究目的及意义

2．实验材料与方法

2．1．实验材料

2．1．1．质粒和菌株

2．1．2．常用试剂

2．1．3．主要仪器

2．1．4．培养基和主要溶液的配制

2．2．实验方法

2．2．1．目的基因的克隆

2．2．2．目的蛋白的诱导表达及检测

2．2．3．目的蛋白的大量表达

2．2．4．目的蛋白的纯化

2．2．5．目的蛋白的结晶

3．实验结果

3．1．4T-1-TEV-NS1的克隆表达及纯化

3．1．1．目的基因的扩增及回收

3．1．2．载体的莓切与片段回收

3．1．3．pGEX-4T-1-TEV-NS1阳性克隆的鉴定

3．1．4．4T-1-TEV-NS1的表达与纯化

3．1．5．4T-1-TEV-NS1的酶切与纯化

3．2．pET28a-NS1克隆表达及纯化

3．2．1．目的基因的扩增及回收

3．2．2．载体的酶切与片段回收

3．2．3．pET28a-NS1阳性克隆的鉴定

3．2．4．pET28a-NS1的诱导表达

3．2．5．pET28a-NS1的纯化

3．2．6．28a-NS1(Nco Ⅰ/Xho Ⅰ)的结晶

3．3．pET28a-NS1(T49E)的克隆表达及纯化

3．3．1．定点突变

3．3．2．NS1(T49E)的表达与纯化

3．3．3．NS1(T49E)的动态光散射

3．3．4．NS1(T49E)的结晶

3．4．NS1与Crk Ⅰ相互作用实验

3．4．1．pET28a-Crk Ⅰ的克隆与表达

3．4．2．4T-1-TEV-NS1与pET28a-Crk Ⅰ的pull-down实验

3．4．3．4T-1-TEV-NS1与pET28a-Crk Ⅰ的共破碎和共表达实验

3．4．4．pET28a-ED与pET28a-n-SH3的相互作用实验

4．分析与讨论

5．小结

参考文献

附录 缩略词

致谢