太子参环肽HB环化酶基因PhPCY7的克隆及功能验证

摘要

目的:筛选参与太子参环肽HB生物合成的关键酶基因，并利用分子克隆技术获取其cDNA全长序列，同时对其进行生物信息学分析及功能验证，以期从功能基因组水平上解析太子参环肽HB生物合成的基因机制。
　　方法:1.基于课题组前期建立的太子参转录组数据库构建本地数据库，以文献报道的环肽合成酶pcy1基因序列为检索条件，利用本地blast技术进行序列筛选，并结合转录组测序的表达量，分析候选基因的表达模式，筛选太子参环肽HB合成的关键酶基因;2.以贵州施秉太子参块根cDNA为模版，扩增太子参环肽HB合成的关键酶候选基因，并利用生物信息学手段分析该基因的结构及功能;3.利用实时荧光定量PCR技术，分析太子参环肽HB环化酶基因在太子参不同组织、不同生长时期、不同激素处理植株中以及不同种源中的表达规律;4.通过构建太子参环肽HB环化酶基因表达载体，利用原核表达技术从太子参中获取太子参环肽HB环化酶，并通过体外酶促反应和高效液相色谱检测验证其酶活性;5.利用原位杂交技术探讨太子参环肽HB环化酶基因在太子参块根中的组织定位情况。
　　结果:1.从太子参转录组数据库中筛选得到PhPCY1、PhPCY2、PhPCY4、PhPCY5、PhPCY7、PhPCY10等6条基因序列含有与pcy1基因相同的基因结构。其中，PhPCY2、PhPCY4、PhPCY7、PhPCY10基因的地下部分表达量高于地上部分。同时，PhPCY7基因的表达模式与太子参环肽HB含量的积累呈正相关。2.从太子参植株中成功扩增并克隆得到PhPCY7基因。基因结构分析显示，PhPCY7基因cDNA长度为2294bp。其中包含2199bp的开放阅读框(ORF)，编码733个氨基酸。生物信息学分析显示，PhPCY7基因编码的蛋白分子量约为83.17kDa。同源比对分析显示其氨基酸序列中含有Ser(S)、His(H)、Asp(D)三个脯氨酰内肽酶家族特有的活性中心位点。系统进化分析显示，PhPCY7基因与太子参同科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis的pcy1基因遗传距离最近。3.实时荧光定量PCR技术分析发现，PhPCY7基因表达量的高低依次为:块根韧皮部＞须根＞果实＞叶＞茎＞块根木质部，与太子参环肽HB的含量变化一致。太子参盛花期（第40天至第60天）PhPCY7的表达差异极为明显，整体表达为:低——高——低，与太子参环肽HB含量呈现出截然相反的变化趋势。4.不同激素处理实验结果显示，赤霉素和多效唑处理组中，PhPCY7基因在6月下旬～7月上旬的上调表达主要受赤霉素影响。5.成功构建了太子参PhPCY7基因的原核表达载体pET28a-PhPCY7和pET32a-PhPCY7:在18℃条件下pET28a-PhPCY7原核表达载体所得的菌液沉淀液中含有目的蛋白，其表达蛋白大小约为88.27kDa。6.分别以太子参环肽HB的完整前体及含C端前体进行体外酶促反应，结果显示，太子参PhPCY7蛋白可催化含C端太子参环肽HB前体进行环化，其环肽HB产率为15.74ng·mL-1·h-1。7.通过对江苏句容、贵州施秉以及福建柘荣种源的太子参进行PhPCY7基因的克隆发现，福建柘荣种源的太子参中PhPCY7基因存在108bp的基因缺失。同时，通过不同种源太子参PhPCY7基因的表达水平进行了实时荧光定量分析，结果显示，不同种源太子参中PhPCY7基因的表达量存在明显的差异，其中，在福建柘荣太子参中PhPCY7基因几乎检测不到表达。8.成功建构了太子参mRNA原位杂交所需的pGEM-PhPCY7载体及太子参块根石蜡切片体系，并初步明确该基因定位于太子参块根的韧皮部。
　　结论:本论文获得太子参环肽HB合成的关键酶基因PhPCY7。利用实时荧光定量PCR技术解析了PhPCY7基因的表达模式和表达规律，明确了该基因在太子参环肽合成过程中所扮演的角色，也为指导太子参定向栽培及采收提供了分子理论基础。同时，通过原核表达技术、体外酶促反应以及mRNA原位杂交技术，确定了PhPCY7基因编码的蛋白具有环化太子参含C端线性前体肽的功能，为太子参环肽类成分生物合成途径的解析提供了前期的研究基础。

目录

声明

摘要

前言

第一章太子参环肽HB生物合成途径基因的筛选

第一节太子参环肽环化酶候选基因的转录组数据库筛选与分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二节太子参环肽环化酶基因PhPCY7的表达模式分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三节太子参环化酶基因PhPCY7的克隆及生物信息学分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

本章小结

第二章太子参环化酶基因PhPCY7的原核表达与酶活分析

1材料

1．1试验材料

1．2主要仪器设备

1．3主要试剂

1．4试验所需引物及序列

2方法

2．1太子参环化酶基因PhPCY7原核表达载体的构建

2．2太子参环化酶蛋白PhPCY7的诱导表达

2．3太子参环化酶蛋白PhPCY7的大量诱导及纯化

2．4太子参环化酶蛋白PhPCY7的活性分析

3结果

3．1太子参环化酶基因PhPCY7原核表达载体的构建

3．2太子参环化酶蛋白PhPCY7原核表达的条件优选

3．3纯化太子参环化酶蛋白PhPCY7的凝胶电泳分析

3．4太子参环化酶蛋白PhPCY7的浓度测定

3．5太子参环化酶蛋白PhPCY7的体外酶促反应

4讨论

第三章太子参环化酶基因PhPCY7组织定位及表达规律分析

第一节太子参环化酶基因PhPCY7的组织定位

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二节不同种源太子参中PhPCI，7基因的表达规律

1材料

2方法

3．结果

4．讨论

第三节不同激素处理下太子参PhPCY7基因的表达规律

1材料

2方法

3．结果

4．讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢