1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶生物砖元件与酶学性质研究

摘要

1，3-丙二醇是一种应用广泛的重要化工原料。利用甘油生物法合成1，3-丙二醇具有原料可再生、过程环境友好等特点，具有广阔的发展前景。这一生物转化过程中，一部分甘油经历氧化路径转化成二羟基丙酮(DHA)并释放还原力辅酶NADH;另一部分甘油经历还原路径，先脱水生成3-羟基丙醛，再进一步被1，3-丙二醇氧化还原酶还原成目标产物1，3-丙二醇，并伴随着消耗氧化途径生成的还原力NADH。目前，单一辅酶无法为甘油还原路径提供足够的还原力，虽然联合利用两种辅酶可以提高最终的生产效果，但其中的重要科学问题——这两种辅酶的并用机制还不清晰。为此，本文利用新兴的合成生物学方法，通过设计生物砖元件及生物系统来调控基于两种辅酶的1，3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶的表达，以便对辅酶并用的内在机制进行分析和建模，为构建更优的1，3-丙二醇生物合成体系奠定基础。
　　本文构建了编码基因分别为dhaT基因和yqhD基因的两类生物砖元件，可相应地表达出依赖于辅酶NADH和NADPH的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)及其同工酶(YQHD)。在此基础上，研究了不同生物砖元件的表达效率，并对1，3-丙二醇氧化还原酶表达最优培养条件和酶活性质进行探讨。本研究的主要内容和结果如下:
　　一、构建了分别编码PDOR及YQHD的基因dhaT和yqhD的生物砖元件库。dhaT与yqhD基因分别源自Klebsiellapneumoniae和E.coli，通过PCR扩增，并将其标准化。根据生物砖标准组装方法依次将核糖体结合位点RBS，启动子T7promoter，终止子TTterminator与目的基因dhaT和yqhD连接，构建成具有不同表达效率(RBS1.0、RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07)的生物砖1，3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶库。
　　二、考察了pSB1A2-T7-RBS-dhaT-TT合成表达系统的表达条件。首先对破碎条件进行摸索，最适破碎条件是175W，破碎时间3s，间歇时间3s。然后对诱导时间，诱导温度，IPTG用量进行考察，最优诱导条件为IPTG0.1mM、30℃、150rpm诱导10h。与优化前的酶活力相比，基于RBS1.0的酶活力显著提高，粗酶活由52U/ml提高到211U/ml，比活由12.1U/mg提高到40.3U/mg，高于现有文献报道值。而基于其他RBS(RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07)优化后也比优化前的酶活提高了2倍左右。
　　三、考察了PDOR无细胞抽提液的酶学性质。该酶的最适宜环境为45℃，pH11.0，且该酶在此条件下具备一定稳定性。考察发现离子强度对酶活影响较大，Mn2+对酶有极强的激活作用;Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+对酶活力有一定的抑制作用;Cu2+、Zn2+则对酶活力有完全抑制作用;而钾离子强度在低于1.0mol/L时有激活作用，在高于1.0mol/L时有抑制作用。该酶对底物的选择性很强，只对1，3-丙二醇表现出活性。1，3-丙二醇氧化还原酶以1，3-丙二醇和NAD+为底物的米氏常数分别为28.5mmol/L和2.62mmol/L。

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摘要

第一章 文献综述

1．1 1,3-丙二醇的概况

1．1．1 1,3-丙二醇性质与应用

1．1．2 1,3-丙二醇生产情况和主要生产方法

1．2 生产1,3-丙二醇的不同策略

1．2．1 葡萄糖生物转化生产1,3-丙二醇

1．2．2 甘油生物转化生产1,3-丙二醇

1．2．3 基因工程改造

1．3 甘油转化法生产1,3-丙二醇的研究进展

1．3．1 1,3-丙二醇生产菌种

1．3．2 1,3-丙二醇生物合成途径

1．3．3 甘油转化1,3-丙二醇的关键酶

1．4 1,3-丙二醇氧化还原酶概况

1．4．1 1,3-丙二醇氧化还原酶研究进展

1．4．2 PDOR酶学性质研究

1．5 合成生物学

1．5．1 合成生物学定义

1．5．2 生物砖

1．6 本课题由来及研究意义

第二章 dhaT与yqhD标准生物砖元件的构建

2．1 实验材料及仪器

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 工具酶、Marker及试剂盒

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 培养基和常用溶液

2．2 实验方法

2．2．1 dhaT基因的标准化

2．2．2 yqhD基因的标准化

2．3 结果与讨论

2．3．1 dhaT基因的标准化

2．3．2 dhaT基因的定点突变与鉴定

2．3．3 目的基因yqhD的扩增

2．3．4 yqhD基因的标准化PCR

2．4 小结

第三章 不同RBS序列dhaT与yqhD表达系统的构建

3．1 实验材料

3．1．1 菌种与质粒

3．1．2 工具酶、Marker及试剂盒

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 培养基和常用溶液

3．2 实验方法

3．2．1 DNA kit使用方法

3．2．2 不同RBS与dhaT,yqhD连接

3．2．3 T7 promoter与pSB1A2-RBS-dhaT,pSB1A2-RBS-yqhD连接

3．2．4 pSB1AK8-T7-RBS-dhaT,pSB1AK8-T7-RBS-yqhD与pSB1AK3-TT连接

3．2．5 pSB1AK3-T7-RBsT-TT,pSB1AK3-T7-RBS-yqhD-TT与pSB1A2连接

3．3 实验结果

3．3．1 不同RBS,T7 promoter验证

3．3．2 不同RBS与dhaT,yqhD连接

3．3．3 pSB1AK8-T7-RBS-dhaT,pSB1AK8-T7-RBS-yqhD构建

3．3．4 pSB1A2-T7-RBS-dhaT-TT,pSB1A2-T7-RBS-yqhD-TT构建

3．4 小结

第四章 PDOR表达条件优化及酶学性质测定

4．1 实验材料及仪器

4．1．1 菌种及质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要实验仪器

4．1．4 各种溶液、缓冲液及其配制方法

4．2 实验方法

4．2．1 重组大肠杆菌诱导表达

4．2．2 无细胞抽提物的制备

4．2．3 蛋白含量的测定

4．2．4 PDOR酶活力测定

4．2．5 最适pH和pH稳定性

4．2．6 最适温度和温度稳定性

4．2．7 离子强度对酶活力影响

4．2．8 不同金属离子对酶活力影响

4．2．9 酶对几种底物的相对活力

4．2．10 动力学参数

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

4．3．2 PDOR表达条件优化

4．3．3 酶学性质

4．4 小结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

附录

硕士期间发表论文

致谢