基于新型智能响应水凝胶材料的便携式定量检测新方法

摘要

近年来，各种疾病的发病率居高不下，对即时诊断提出了更高的要求。与此同时，科技的进步以及人们生活水平的提高，为即时诊断的发展创造了条件。基于以上背景，各种即时诊断方法应运而生，并迅速成为研究热点。所谓即时诊断(Point of Care Test，POC Test)，是指在病人身旁迅速获得检测结果的一项技术手段。该技术具有成本低廉、操作简便、实时快速、定量准确、用户友好等多项优点，在医疗、环境检测、食品安全等领域备受关注。尽管即时检测的各种创新型成功实例百花齐放，但目前成功的商业化产品案例仍十分有限，其中尤以最广泛普及、最具有实用价值的个人用血糖仪为代表。但是，血糖仪的检测靶标仅局限于葡萄糖分子。为拓展血糖仪的检测靶标发展一套通用性强的检测平台，本文将视线投向核酸适体交联智能水凝胶，并构建其与血糖仪联用检测体系。水凝胶是一类具有三维网状结构，能响应多种化学、物理刺激的亲水性高分子聚合物。核酸适体是20世纪90年代兴起的一类能够特异性地结合靶标分子的新型的分析、诊断分子。特别是将其与分子生物学信号放大技术结合，为解决遗传变异、疾病诊断、治疗等难题提供了新的思路，愈加成为化学、生物医学等相关领域的研究热点，并不断向普及化、便携化等方向发展。基于此，本文通过DNA自组装方法和分子识别技术，发展快速、方便、廉价的即时诊断装置，成功地把血糖仪的检测靶标拓展到任何感兴趣的分子。具体开展了如下几部分工作:
　　(1)合成丙烯酸亚磷酰胺单体，设计、合成、制备了核酸适体交联三维水凝胶，理论计算并分析了凝胶结构交联情况，以金纳米粒子作为可视化信号分子考察了水凝胶成胶-解胶过程。水凝胶工作原理如下:将两条DNA短链（链A和链B）与丙烯酰胺单体共聚生成线性聚丙烯酰胺聚合链A(PS-A)和聚合链B(PS-B)。其中链A和B分别能够与DNA核酸适体序列linker aptamer的两端互补。待PS-A和PS-B充分混匀后，向其中加入linker aptamer链。随着核酸适体的加入，链A、链B与之杂交得到三链复合体的结构，作为交联剂使得线性聚丙烯酰胺PS-A和PS-B形成三维网状水凝胶结构，并将金纳米粒子包裹于其中。外界刺激，如DNaseⅠ（非特异性）和可卡因（特异性），能够瓦解交联结构，释放出金纳米粒子，并可借助肉眼观测到凝胶结构的改变。
　　(2)以可卡因为模型分子，建立了目标响应“sweet”水凝胶手持式传感体系，基于DNA碱基对识别和核酸适体-靶分子相互作用之间的相互竞争过程引发的酶促反应，实现了核酸适体交联水凝胶与个人用血糖仪的结合。具体原理同上，以淀粉葡萄糖苷酶替代金纳米粒子作为信号的响应分子。当体系中不存在靶标时，淀粉葡萄糖苷酶稳定地包裹在胶中，导致其与胶外溶液中底物淀粉的物理分离，酶促反应无法发生;加入靶标后，核酸适体特异性的优先与靶标相结合形成靶标-核酸适体复合体，导致水凝胶瓦解并释放出淀粉葡萄糖苷酶。释放出的酶分子催化溶液相中淀粉水解产生大量的葡萄糖，借由个人用血糖仪(PGM)定量读出信号值。该方法具有良好的重现性和稳定性，水凝胶保藏长达3个月后仍具有良好的准确度。
　　(3)为了验证方法的通用性，先后设计了针对可卡因和腺嘌呤核苷三磷酸检测的核酸适体交联水凝胶，分别应用于对可卡因和腺嘌呤核苷三磷酸的定量分析。采用相同的工作机理，将高聚物链按照一定浓度比例制备得到包裹有淀粉葡萄糖苷酶的交联水凝胶。核酸适体-靶标复合物的形成导致水凝胶瓦解，释放出的酶分子催化底物淀粉水解，产生放大的可由血糖仪读出的葡萄糖浓度信号，从而实现对靶标的检测。针对缓冲体系内可卡因的检出限达3.8μM，针对缓冲体系内的ATP，该方法的检出限为15.5μM。同时，上述体系成功地实现了复杂体系（尿液、血液）中可卡因的检测。
　　本论文建立了一种目标响应“sweet”水凝胶手持式传感器，该传感器操作简便、成本低廉，具有快速、灵敏、选择性高、不易受复杂环境干扰等优点，有望应用于重要生物分子的药物监控和临床诊断等过程，并发展成为一种设计简单灵活、成本低廉的通用性检测方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 手持式传感技术的发展及应用

1．1．1 即时检测的定义及意义

1．1．2 即时诊断的发展现状

1．1．3 即时诊断的发展方向

1．1．4 血糖仪在即时诊断中的应用

1．2 水凝胶在生物传感中的应用

1．2．1水凝胶的目标响应机制

1．2．2 水凝胶的应用举例

1．2．3 DNA水凝胶传感器

1．3 核酸适体技术的发展

1．3．1 核酸适体筛选技术的发展

1．3．2 核酸适体的分子识别机制及其在分子生物学中的应用

1．4 基于酶放大的分子生物学检测技术

1．4．1 核酸酶介导的信号转导与放大技术

1．4．2 非核酸酶介导的信号转导与放大

1．5 淀粉酶的分类

1．5．1 alpha-淀粉酶(α-淀粉酶)

1．5．2 beta-淀粉酶(β-淀粉酶)

1．5．3 gama-淀粉酶(γ-淀粉酶)

1．5．4 小结

1．6 论文的研究目的及主要设想

第二章 核酸适体交联水凝胶的制备与表征

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器、材料和试剂

2．2．2 丙烯酸亚磷酰胺单体的合成

2．2．3 甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

2．2．4 水凝胶的制备

2．3 结果与讨论

2．3．1 甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

2．3．2 聚合物链分子量的考察

2．3．3 水凝胶中交联度的计算

2．3．4 DNA水凝胶杂交成胶-刺激解胶情况考察

2．3．5 水凝胶包埋与释放金纳米粒子的动力学情况

2．4 本章小结

第三章 基于核酸适体水凝胶的手持式传感体系的建立

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器、材料和试剂

3．2．2 丙烯酸亚磷酰胺单体的合成

3．2．3 甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

3．2．4 水凝胶的制备

3．2．5 水凝胶-血糖计体系定量步骤

3．3 结果与讨论

3．3．1 淀粉酶的选择

3．3．2 淀粉酶缓冲体系优化

3．3．3 考察水凝胶包裹淀粉葡萄糖苷酶的酶活性

3．3．4 淀粉酶包裹量考察

3．3．5 淀粉用量优化

3．3．6 可卡因检测的灵敏度与选择性实验

3．3．7 存在葡萄糖背景的样品测定

3．3．8 体系稳定性考察

3．4 本章小结

第四章 基于核酸适体水凝胶的手持式传感的应用实例

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器、材料和试剂

4．2．2 丙烯酸亚磷酰胺单体的合成

4．2．3 甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

4．2．4 水凝胶的制备

4．2．5 水凝胶-血糖计体系定量步骤

4．3 结果与讨论

4．3．1 可卡因检测的灵敏度与选择性实验

4．3．2 灵敏度考察及优化

4．3．3 复杂体系中可卡因含量检测

4．3．4 与传统方法的比较

4．3．5 SH-PGM体系对ATP的高灵敏分析

4．3．6 SH-PGM体系对ATP的选择性分析

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

作者攻读硕士学位期间发表论文

致谢