重组人乳头瘤病毒31型L1蛋白的基础及应用研究

摘要

人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种小的无包膜DNA病毒，能够引起生殖器部位的多种良性及恶性病变。其中以宫颈癌危害最为严重。目前，世界范围内每年宫颈癌新发病例约50万，位居女性常见癌症的第二位，其中86％的病例发生在发展中国家。研究表明，全球80.3％的宫颈癌与高危型的HPV16(53.5％)、18(17.2％)、45(6.7％)和31(2.9％)相关。现有的第一个宫颈癌疫苗已能够对HPV16/18两种高危型病毒的感染提供保护，但是对上述两种型别之外的高危HPV保护率有限。对于第二代宫颈癌疫苗的一个主要要求就是必须能够包含更多的高危型别，解决第一代疫苗覆盖范围有限这一严重不足。HPV31作为一个重要的高危HPV型别是第二代宫颈癌疫苗所必需包含的组份。本研究对HPV31L1蛋白的表达菌株构建，表达及纯化工艺，免疫原性等方面开展了研究，以期为包含HPV31成份的第二代宫颈癌疫苗研究奠定基础。
　　 本研究构建了pTO-T7-31N27C表达载体，转化大肠杆菌Er2566，以非融合的形式可溶表达了HPV31N27CL1蛋白，并经过SP、CHT-Ⅱ和Butyl等一系列色谱层析纯化后，其纯度高于90％。纯化的L1蛋白在适宜pH和盐浓度的条件下，可以组装成病毒颗粒(Virus-LikeParticles，VLPs)。进一步将小量制备工艺放大到中试规模，所制备的VLP原液分子量、细菌内毒素和外源DNA含量等质量指标能符合中国药典要求。
　　 本研究将HPV31VLP吸附于氢氧化铝佐剂上，制备HPV31单价疫苗。该疫苗在小鼠试验中被证实能够诱导产生中和抗体:免后5week中和抗体滴度达到104，于2week和6week分别加强免疫，则中和抗体滴度可上升至105。而HPV31VLP疫苗的效力ED50为0.004μg。
　　 本研究中还使用HPV31VLP免疫小鼠，获得了HPV31型单克隆抗体16株，其中有4株兔多抗血清阻断率超过50％的优势单抗，可作为HPV31VLPs质控用单抗。
　　 此外，本研究还发现不同的终止密码子能对HPV31L1基因翻译产生影响，如果将TAA替换成TAG，将大幅提高了翻译终止的效率，避免了错误终止的HPV31L1蛋白的产生，减少了纯化工艺的难度，使原液中蛋白纯度从85％提高到92％。
　　 综合上所述，本研究成功制备了大肠杆菌表达系统来源的HPV31VLP疫苗，该疫苗各项指标均能够符合中国药典相关要求，为第二代宫颈癌疫苗奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

1．HPV简介

2．HPV的结构

2．1．HPV基因结构

2．2．HPV蛋白与病毒结构

2．3．HPV L1蛋白的自组装

2．4．HPV L2蛋白

3．HPV的分型

4．HPV感染及致病机制

5．HPV的免疫机制

6．HPV与宫颈癌流行病学

7．HPV疫苗研究现状

7．1．HPV预防性疫苗研究

7．2．HPV治疗性疫苗研究

7．3．现有的HPV疫苗

8．重组HPV L1蛋白表达系统

8．1．真核表达系统

8．2．原核表达系统

9．本研究的目的、思路及意义

材料与方法

1．材料

1．1．仪器

1．2．工程菌、细胞株、质粒和基因

1．3．实验动物

1．4．酶和单抗

1．5．试剂

2．方法

2．1．常见溶液及培养基配制

2．2．常规分子克隆生物学实验方法

2．3．蛋白质表达和纯化方法

2．4．检测方法

2．5．HPV疫苗原液检定

2．6．动物免疫

2．7．单抗制备与纯化

结果与分析

第一部分 HPV31N27C VLP疫苗工艺研究

1．HPV31N27C VLP小量制备方法的建立

2．HPV31N27C VLP中试研究

第二部分 HPV31N27C L1终止密码子优化

1．L1终止密码子优化

2．HPV31N27C L1(TAG)性质鉴定

3．小结

第三部分 HPV31 VLP疫苗制备与免疫原性研究

1．建立HPV31型假病毒中和实验检测方法

2．HPV31型单抗筛选与鉴定

3．HPV31N27C VLP单价疫苗配制

4．HPV31N27C VLP疫苗动物免疫原性评价

5．小结

讨论

小结与展望

参考文献

致谢