基于聚苯乙烯微珠敏感元件的表面改性、抗体分子定向固定化及催化信号放大分析研究

摘要

肿瘤患者血清中肿瘤相关性蛋白质因子的灵敏、准确检测对于肿瘤早期诊断和治疗具有十分重要的意义。检测灵敏度的提高关键在于信噪比的提高，在液相芯片检测体系中，信噪比的提高涉及:改善其核心元件微球的表面生物探针分子的固定化效果，特别是实现定向固定以提高捕获待测靶分子的能力;非特异性检测背景的降低;以及检测信号放大等多方面。本文基于优化以聚苯乙烯微球为敏感元件的液相芯片免疫分析体系，应用于临床血清样品中肿瘤标志蛋白的检测，以提高检测灵敏度为目的，在以上三个方面做了相应研究。研究工作主要有以下三部分:
　　 第一章介绍液相芯片的基本原理和提高芯片免疫分析灵敏度的组合策略。一、介绍了固相载体表面探针分子的不同化学交联固定化方法、其在免疫分析中的优缺点以及制约分析灵敏度的相关因素;二、阐述了液相芯片中普遍存在的由非特异性吸附引起的高背景，介绍了目前抑制非特异性吸附的主要方法和研究进展;三、介绍了目前免疫信号放大技术的进展。根据这些内容，基于实验室的流式微珠免疫分析体系，提出了对应的实验方案。
　　 第二章研究以羧基聚苯乙烯微球为载体的抗体微球敏感元件的制备方法。以构建抗体定向性好，免疫活性高的抗体微球为目的，针对基于EDC/NHS催化体系的直接固定化和载体酰肼活化、抗体糖基氧化固定化两种化学交联固定化方法中影响抗体固定化效果的相关因素进行了研究，采用荧光抗体与抗体微球免疫反应、流式细胞仪检测的方法来表征抗体整体固定化量以及定向固定量，数据显示糖基固定化整体固定量下降10％左右，但是定向固定量是直接固定的3倍，可以在后续的免疫反应中更灵敏地捕获抗原。
　　 第三章研究微球表面改性以降低非特异性蛋白吸附。基于原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在微球表面聚合形成亲水性聚合物链以抵抗疏水性的蛋白吸附。以氨基微球为基质，化学偶联溴代小分子引发剂，在Cu(Ⅰ)-联吡啶体系的催化作用下，分别以丙烯酸聚乙二醇酯(PEGMA)和两性离子化合物羧基甜菜碱丙烯酸酯(CBAA)为单体在微球表面聚合形成带有寡聚乙二醇(OEG)和两性离子侧链的聚合物链。分别用荧光蛋白吸附法和考马斯亮蓝法考察了两种表面改性微球的蛋白吸附情况，并与改性之前的微球进行了定量比较，两种改性微球蛋白吸附量分别降低了54％和90％，成功构建了表面抗吸附的聚苯乙烯微球载体。
　　 第四章研究免疫信号放大方法。在传统的液相芯片双抗夹心免疫分析体系下，运用催化信号放大技术增强特异性免疫信号，提高信噪比。成功合成并表征了催化反应的关键底物----荧光素标记酪胺，对影响催化反应效果的相关因素进行了考察，在优化条件下，将传统方法和催化信号放大方法同时应用于肝癌病人血清样本中甲胎蛋白的检测，在传统方法的基础上，运用催化信号放大技术信噪比提高了5-10倍，然后进一步发展了超敏的催化信号放大法，使免疫信号强度进一步增强。分别用传统检测法、催化信号放大法、超敏催化信号放大法用于甲胎蛋白定量检测，其检测下限分别为9.1ng/ml，0.93ng/ml，0.097ng/ml。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 液相芯片技术简介

1．2 提高液相芯片检测灵敏度，降低检测下限

1．2．1 生物分子定向固定化技术

1．2．2 液相芯片中非特异性吸附引起的高背景的抑制

1．2．3 免疫信号放大技术

1．3 总结及本论文的研究设想

参考文献

第2章 羧基聚苯乙烯微珠的抗体定向固定化研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 直接法固定鼠抗羊单克隆抗体

2．2．3 糖基法固定鼠抗羊单克隆抗体

2．2．4 流式细胞仪定量表征固定化抗体微珠

2．2．5 粒度分析仪表征抗体固定化前后微珠平均粒径及表面电位

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验方案

2．3．1 直接固定法中抗体偶联缓冲液对固定化效果的影响

2．3．2 直接固定法中偶联缓冲液离子强度的影响

2．3．3 直接固定法中活化剂EDC／NHS浓度的影响

2．3．4 直接固定法中偶联时间的影响

2．3．5 微珠酰肼活化效率表征

2．3．6 PAS反应表征抗体氧化程度

2．3．7 抗体氧化缓冲液浓度及氧化时间对糖基固定化效果的影响

2．3．8 直接固定化与糖基固定化效果比较

2．3．9 粒度分布仪表征微珠抗体固定前后粒径及表面电位变化

2．4 讨论

参考文献

第3章 微球表面聚合改性抑制非特异性吸附研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器和试剂

3．2．2 氨基聚苯乙烯(PS-NH2)微球的电导滴定

3．2．3 氨基聚苯乙烯(PS-NH2)微球表面接引发剂2-溴代异丁酸

3．2．4 PEGMA修饰含引发剂的氨基聚苯乙烯微球

3．2．5 CBAA修饰含引发剂的氨基聚苯乙烯微球

3．2．6 FITC-BSA吸附实验

3．2．7 考马斯亮蓝法蛋白吸附实验

3．2．8 形貌及元素分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验设计思路

3．3．2 氨基聚苯乙烯微球表面氨基含量测定

3．3．3 两性离子单体合成产物核磁分析

3．3．4 两种引入方式的微球表面元素分析(XPS分析)

3．3．5 表面聚合的实现

3．4 本章小结

参考文献

第4章 催化信号放大法扩增免疫检测信号

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器和试剂

4．2．2 传统双抗夹心法检测血清中甲胎蛋白

4．2．3 催化信号放大法(CARD)检测血清中甲胎蛋白

4．2．4 超敏催化信号放大法(Super-CARD)检测血清中甲胎蛋白

4．3 结果和讨论

4．3．1 实验方案及原理

4．3．2 酪胺盐荧光素复合物的质谱表征

4．3．3 催化反应缓冲液优化

4．3．4 催化反应底物(FITC-tyr)浓度优化

4．3．5 H2O2浓度优化

4．3．6 酶标抗体稀释度的优化

4．3．7 传统方法与催化信号法定量检测结果比较

4．3．8 超敏催化信号放大法(Super-CARD)

4．3．9 传统方法、催化信号放大法及超敏催化信号放大法定量检测

4．3．10 与电化学发光方法检测结果相关性考察

4．4 本章小结

参考文献

第5章 总结

攻读硕士期间发表与交流论文

致谢