PKCθ/PKCε-PKD3-NF-ΚB信号通路对prostratin激活HIV转录是必要的

摘要

目前，全球有超过3亿人感染了艾滋病毒(HIV)，仅2010年的新增感染人数就超过2百万。人们为治疗艾滋病做了长期的努力并取得了一定的进展，目前艾滋病的治疗手段主要为抗逆转录病毒治疗法（antiretroviraltherapyART）。虽然ART疗法可以延长感染者的生命至正常人的状态。但无法清除患者体内的HIV，而必须终身治疗，一旦停止用药，潜伏的HIV就会再次活化重新感染，给患者带来痛苦和沉重的经济负担。
　　 研究发现prostratin及其它非肿瘤促进性佛波酯类药物能够诱导潜伏的HIV活化，这为艾滋病的治愈带来新的曙光。Prostratin是一种新型的佛波酯类药物，存在于一种叫Homalanthusnutans植物的皮中。研究发现Prostratin能够抑制HIV感染者的病毒扩散，并且能够诱导潜伏在静息的ACH2和U1细胞中HIV-1的活化[1，2]。
　　 本研究以Hela、293T以及稳定整合HIV-1LTRLuciferasereportergene的HeLa细胞为模型，通过WesternBlot，qRT-PCR等一系列实验方法进行研究，旨在揭示prostratin诱导激活潜伏HIV的信号通路及其分子机制。我们的研究结果表明:prostratin能够有效激活Hela细胞及293T细胞中HIV-LTR-Luciferase报告基因的表达;并且我们发现了PKCθ、PKCε和PKD3是prostratin诱导激活HIV-LTR-Luciferase报告基因信号通路中的重要中间分子，在信号传递中PKCθ和PKCε是PKD3的上游。PKCθ和PKCε通过磷酸化PKD3使其激活，以此方式将上游的信号通过PKD3传递到下游。我们还发现在PKD3的下游NF-κB是激活HIV-LTR-Luciferase报告基因的表达的重要转录因子。由此我们确立了一条prostratin诱导激活HIV-LTR-Luciferase报告基因的信号通路:prostratin-PKCθ/PKCε-PKD3-NF-κB-HIV-LTR-Luciferase报告基因。

目录

声明

英文缩略语对照表

摘要

第一章 前言

1．1 HIV的治疗

1．1．1 HIV的潜伏

1．1．2 潜伏HIV的清除策略

1．2 PKC(protein kinase C，PKC)简介

1．2．1 PKC家族及其功能

1．2．2 PKC信号通路与潜伏HIV-1的活化

1．3 蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)

1．3．1 PKDs的结构及功能特性

1．3．2 PKDs的活性调控

1．3．3 PKD的功能

1．4 转录因子NF-κB

1．4．1 NF-κB信号通路的调节

1．4．2 HIV-1的转录依赖NF-κB

1．5 本课题研究的目标和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验药品、试剂与仪器

2．1．1 细胞株、菌株和质粒资源

2．1．2 主要试剂和材料

2．1．3 主要实验仪器和耗材

2．2 常用溶液配方

2．2．1 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化相关溶液

2．2．2 质粒DNA制备相关溶液

2．2．3 质粒DNA克隆相关溶液

2．2．4 细胞培养、转染及感染相关溶液

2．2．5 生化实验相关溶液

2．2．6 Western Blot相关溶液

2．3 实验方法

2．3．1 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

2．3．2 质粒DNA的制备

2．3．3 DNA样品琼脂糖凝胶电泳

2．3．4 琼脂糖胶回收DNA片段(QIAGEN试剂盒)和DNA连接

2．3．5 普通PCR反应

2．3．6 点突变PCR应(改进型QuikChange方案)

2．3．7 细胞学相关实验

2．3．8 反转录PCR实时定量PCR(Realtime-PCR，RT-PCR)

第三章 结果与讨论

3．1 在Hela细胞中Prostratin可以激活HIV-LTR-Luciferase报告基因表达

3．2 Prostratin激活HIV-LTR-Luciferase报告基因转录的起始

3．3 在Hela细胞中某些新型PKC参与Prostratin对HIV-LTR-Luciferase报告基因的激活

3．4 PKD家族在不同细胞株中的表达情况及shRNA的筛选

3．5 敲除PKD3可以抑制prostratin对HIV-LTR-Luciferase报告基因的激活

3．6 过表达持续活化的PKD3可以激活HIV-LTR-Luciferase报告基因的表达

3．7 Prostratin处理可以激活PKD3

3．8 抑制某些新型PKC亚型可以抑制prostratin对PKD3的活化

3．9 持续活化的新型PKCθ和PKCε可以活化PKD3并能激活HIV-LTR-Luciferase报告基因的表达

3．10 抑制NF-κB可以抑制Prostratin对HIV-LTR-Luciferase报告基因的表达

3．11 Prostratin激活NF-κB-Luciferase报告基因的表达

3．12 持续活化的PKD3可以激活NF-κB报告基因的表达

3．13 结论

3．14 讨论与展望

参考文献

致谢