海洋中三株菌的多相分类和印度洋沉积物PKSI KS domain克隆基因文库多样性分析

摘要

大洋是海洋的主体部分，约占海洋总面积的90.3％，具有丰富的微生物资源，约有1×106～2×108种海洋微生物，但以目前技术可培养的极少。深海，一般指的是位于海洋1000m以下的深度区域，具有低温、高压、营养匮乏等特征，局部还具有高温、高盐、高酸碱等极端环境。为适应这种极端环境，深海微生物必然具有独特的生理代谢机制。因此，对分离出的微生物进行系统分类鉴定，对微生物菌种资源的开发具有重要意义。
　　 本文对分离自东西伯利亚海和印度洋热液区沉积物的三个潜在新种，运用现代多相分类鉴定方法，对潜在新种进行了形态学，生理生化特征，化学分类特征及分子分类的鉴定，确定了这三株菌的分类地位。以能生物合成聚酮类化合物的Ⅰ型聚酮合酶基因为研究对象，对印度洋TVG03、TVG04和TVG05三个站位的Ⅰ型PKS基因多样性进行了研究，主要结果如下:
　　 (1)1111S-42T分离自东西伯利亚海。该菌属于芽孢八叠球菌属（Sporosarcina），革兰氏阳性。在28℃TSA培养基上培养36h后，透射电镜下观察，菌单个的或成对出现，杆状;在TSA上的克隆是浅橙色，圆形的，不透明，凸状。该菌生长范围是4-30℃，最适温度为28-30℃;pH范围为7.0-8.5，最适pH是7.5;该菌在等于和大于8％Nacl浓度不生长，最适盐度为1％。通过16SrRNA比对，相似最高依次为S.contaminansCCUG53915T(97.27％)和S.soli180T(97.18％)。该菌肽聚糖类型为A4α;主要的极性酯是Diphosphatidylglycerol(DPG)、Phosphatidylglycerol(PG)、Phosphatidylethanolamine(PE);主要的醌是MK-7;主要的脂肪酸包括iso-C15∶0(29.81％)，anteiso-C15∶0(34.41％)，anteiso-C17∶0(22.37％);(G+C)mol％含量39.9％。典型菌株为1111S-42T(=LMG27494T=CGMCC1.12516T)。
　　 (2)0704P10-1T分离自印度洋热液沉积物。该菌属于两面神菌属（Janibacter），革兰氏阳性菌。在28℃TSA培养基上培养36h后，透射电镜下观察，菌单个的或成对出现，球状，无孢子，不游动;在TSA上的克隆是雪白色，圆形的，不透明，凸状。该菌生长范围是15-40℃，最适温度为28-30℃;pH范围为6-11，最适pH是7-8;该菌在等于和大于8％NaCl浓度不生长，生长不需要盐分。通过16SrRNA比对，相似最高依次为JanibacterterraeCS12T(98.7％)，JanibacteranophelesH2.16BT(98.4％)。该菌细胞壁中含有meso-DAP。主要的极性酯是Phospholipids(PLS)、Diphosphatidylglycerol(DPG)、Phosphatidylcholine(PC)、Phosphatidylglycerol(PG)。主要的醌是MK-8(H4)。主要的脂肪酸包括iso-C16∶0(44.22％)，C17∶1w8c(8.79％)，C18∶1w9c(8.62％)。(G+C)mol％含量为77.6％。典型菌株为0704P10-1T(=LMG27493T=CGMCC1.12511T)。
　　 (3)0704C9-2T分离自印度洋热液沉积物。该菌属于微杆菌属（Microbacterium），革兰氏阳性菌，在28℃TSA培养基上培养36h后，透射电镜下观察，菌都是杆状，无孢子，不游动;TSA上的克隆是黄色的，圆形的，不透明，凸状。该菌生长范围是10-37℃，最适温度为28-30℃;pH范围为6-10，最适pH是7-8;该菌在等于和大于5％NaCl浓度不生长，生长最适NaCl浓度是1％。通过16SrRNA比对，相似最高为MicrobacteriumtestaceumDSM20166T有最大同源性98.77％，主要的极性酯是Diphosphatidylglycerol(DPG)、Phosphatidylglycerol(PG)、Glycolipids(GL)、unknown。主要的醌是MK-11、MK-10、MK-12。主要的脂肪酸包括anteiso-C15∶0(34.42％)、anteiso-C17∶0(25.43％)、iso-C16∶0(21.69％)、iso-C15∶0(10.93％)，(G+C)mol％含量为73.27％。典型菌株为0704PC9-2T(=LMG27542T=CGMCC1.12512T)。
　　 (4)建立印度洋TVG03、TVG04和TVG05三个站位样品的PKS文库，各随机挑选100个PKS克隆子，经验证分别有91个(TVG03)、93个(TVG04)和96个(TVG05)克隆子是正确的，用MspⅠ限制性内切酶进行RFLP酶切分型分析后发现分别有20(TVG03)、15(TVG04)和16(TVG05)个不同基因型的克隆，选取不同基因型的代表克隆保种并测序。三个站位测序结果与Genebankdatabases中的已知氨基酸序列比对，序列相似性分别为:45％-75％、54％-83％和59％-79％。
　　 (5)三个样品氨基酸序列在系统发育树上分成了两个功能组:一个代表KSdomain，以乙酰辅酶A作为开始或延伸单元;另一个组由来源于PKS/NRPS复合酶的一个序列组成的。这个PKS/NRPS复合酶识别AA到一个聚酮延伸单元上。在Ⅰ型聚酮合酶里，KSdomain的组中具有种属多样性，包括Cyanobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria、Planctomycetes、EukaryotaAlveolat和uncluredbacterium。PKS/NRPS酶复合体是由Cyanobacteria、Verrucomicrobia、Proteobacteria和来自环境样品中的unculturedbacterium组成的，其中Cyanobacteria是优势菌群。
　　 本文对分离自东西伯利亚海和印度洋热液区沉积物的三个潜在新种，运用现代多相分类鉴定方法，确定了这三株菌的分类地位。新的菌株可能蕴含着新的次级代谢物质，为以后对菌株生物活性的深入研究提供新的资源。
　　 另一方面，以印度洋深海不同站点的沉积物的海洋微生物为研究对象，通过针对PKSKS基因保守序列的简并引物，采用限制性片段多样性分析(RFLP)技术，考查了沉积物微生物聚酮合成基因的多样性分布，为促进该区域的PKS基因、生物多样性分布，深海热液生物资源的研究和利用奠定了基础。

目录

声明

英文缩略表

摘要

第一章 前言

1 大洋环境概况

2 细菌多相分类研究概况

2．1 细菌分类学的发展

2．2 细菌多相分类研究的具体方法

2．3 现在细菌分类学研究的特点及其发展趋势

3 PKS研究的现状

3．1 聚酮化合物合成酶PKS

3．2 PKS的组合生物学前景

4 本文研究的目的及意义

第二章 三株海洋菌的多相分类

1 引言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 三株海洋菌菌的多相分类鉴定结果和分析

3．1 一株北极来源芽孢八叠球菌多相分类鉴定结果和分析

3．2 一株深海来源两面神菌的多相分类鉴定结果和分析

3．3 一株深海来源微杆菌的多相分类鉴定结果和分析

第三章 印度洋沉积物Ⅰ型聚酮合酶KS domain多样性分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 印度洋深海沉积物总DNA的提取

3．2 PKSI KS domain的扩增

3．3 PKSI KS domain克隆基因文库构建及RFLP分型

3．4 印度洋深海沉积物PKSI KS domain克隆基因文库多样性分析

4 讨论

参考文献

致谢

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