登革2型病毒NGC株诱导HUVEC经AIF相关的非caspase依赖途径凋亡的探索

摘要

目的: 在caspase泛抑制剂z-VAD-fmk的作用下，使用登革2型NGC株病毒（DENV-2 NGC）感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），与未加z-VAD-fmk的感染细胞比较DNA切割率和早期凋亡率，同时检测凋亡细胞胞核中是否存在凋亡诱导因子（AIF），以探明登革2型NGC病毒株是否能够通过凋亡诱导因子相关的非caspase依赖途径诱导HUVEC发生凋亡。 方法: 通过乳鼠颅内接种和C6/36细胞增殖获取登革2型NGC株病毒，经RT-PCR检验和组织培养半数感染量（TCID50）滴定后用于下游实验；用吖啶橙/溴乙锭双染色法检测病毒是否可诱导HUVEC凋亡并观察凋亡细胞形态；将不同浓度的病毒接种于受caspase泛抑制剂z-VAD-fmk作用的HUVEC，动态测定caspase-3活性，并用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术检测细胞的凋亡情况以确证在z-VAD-fmk有效抑制caspase活性的情况下DENV可以经由非caspase依赖的途径诱导HUVEC发生凋亡；再通过免疫印迹法鉴定细胞核内的凋亡诱导因子。 结果: 1.通过乳鼠颅内接种和C6/36体外培养，增殖登革2型NGC株病毒，两种方式增殖所得病毒的TCID50分别为10-7.38、10-5.31。 2.通过吖啶橙/溴乙锭双染色试验初步确定登革2型NGC株病毒能够诱导HUVEC发生凋亡。 3.DENV-2 NGC作用于HUVEC激活了细胞内的caspase-3；使用终浓度为50μg/ml的caspase泛抑制剂z-VAD-fmk显著抑制了caspase-3的活性。 4.HUVEC经z-VAD-fmk作用后，用双抗体夹心ELISA试验和流式细胞术分别检测出DENV-2 NGC诱导的HUVEC凋亡，与不加z-VAD-fmk对照组比较，凋亡指标DNA切割率和早期凋亡率差异均不明显（P>0.05）。 5.在经z-VAD-fmk作用后用DENV-2 NGC诱导发生凋亡的HUVEC的核蛋白提取物中，检测到正常生理状态下应位于线粒体内的AIF，提示该蛋白可能参与了HUVEC经非caspase凋亡的过程。 结论： 在DENV诱导的HUVEC凋亡中，同时存在caspase依赖和非caspase依赖两条途径，AIF可能参与了非caspase依赖的凋亡途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明: 缩略词表

声明

1. 前 言

2. 材料与方法

3.结果

4.讨论

5. 参考文献

7. 致谢

10. 综述：凋亡检测方法Approaches to the Detection of Apoptosis