平滑肌特异性蛋白Smoothelin在糖尿病膀胱病豚鼠膀胱的表达变异

摘要

目的:应用链脲佐霉素(STZ)建立糖尿病豚鼠模型，观察糖尿病膀胱病(DCP)的病程进展，探究平滑肌特异性蛋白Smoothelin在其发病机制中的表达改变以及意义。 方法:50只英国种短毛雌性豚鼠，随机选择42只作为实验组，8只作为对照组。实验组单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，对照组注射相应剂量的枸橼酸缓冲液。全价饲养9周和12周，尾静脉取血通过血糖筛选确定入组豚鼠，中下腹部切开活体暴露膀胱并应用尿动力仪检测残余尿、排尿期最大逼尿肌压、膀胱容量及顺应性的变化，以逼尿肌收缩最大压力下降以及残余尿/膀胱容量＜10％作为糖尿病失代偿组（DCP组）判断依据，确定糖尿病豚鼠病程中的膀胱功能代偿及失代偿不同表现。利用免疫组织化学Maxvision法检测Smoothelin在不同膀胱结构如肌层、粘膜肌层以及血管的表达强度变化。通过蛋白质印迹法以及电泳ECL显色并应用凝胶成像系统对曝光图片上的蛋白条带灰度值进行采集与分析，目的蛋白Smoothelin表达量以内参β-actin进行标准化，对比分析各实验组间蛋白表达的差异情况。 结果:经尾静脉血检测血糖后筛选入组模型20只(随机血糖大于16.8mmol/L)，糖尿病模型成功率47.6％(20/42)。与对照组8只比较，观察糖尿病组豚鼠体重（280.30±7.08）g，较对照组（351.50±10.07）g显著下降(P＜0.01)，并伴有多尿、体重减轻、活动减少等阳性临床症状。经尿动力学检测成功18只（喂养死亡2例），依据DCP判断标准，9周时的9只糖尿病豚鼠中6只膀胱功能代偿，3只功能失代偿(33.3％);而在12周时的9只糖尿病豚鼠中，只有1只膀胱功能代偿，8只功能失代偿(88.9％);对照组实验终点余6只膀胱功能视为正常对照。DCP组豚鼠残余尿(0.72±0.08 ml)，膀胱容量（2.01±0.05 ml），顺应性（0.34±0.04 ml/cmH2O）与对照组及代偿组比较均增加，而最大逼尿肌压力（6.46±0.51 cmH2O）表现最典型，明显低于对照组以及代偿组，以上差异均存在明显统计学意义(P＜0.01)。而在代偿组中，残余尿、膀胱容量、顺应性均较对照组增加，而排尿期最大逼尿肌压(16.57±0.48 cmH2O)亦呈现代偿性增加趋势。但比较于对照组无统计学差异(P＞0.05)。 应用免疫组化(IHC)观察对照组、膀胱功能代偿组以及膀胱功能失代偿组的膀胱组织石蜡切片。Smoothelin抗体免疫染色后，对照组切片逼尿肌组织(MP)肌束清晰分明，间隙均匀，粘膜层突起对称，Smoothelin呈现2+(2/6)～3+(4/6)染色强度。代偿组豚鼠膀胱逼尿肌肌束增粗繁密，间隙拥挤，粘膜层相对增厚，肌层Smoothelin表达多呈强阳性3+(6/7);而失代偿组（DCP组）豚鼠膀胱逼尿肌肌束分布相对分散，间隙不规整，肌条扁平且杂乱，肌层区域Smoothelin表达强度出现下降，以1+(1/11)～2+(8/11)表达为主。在膀胱粘膜肌层(MM)的Smoothelin表达代偿组与失代偿组比较对照组染色强度变弱，但表现明显的是其形态学的改变，代偿组的粘膜肌层厚度较对照组有明显变薄，并且断裂部分明显增多。比较粘膜下层的血管中Smoothelin表达，其表达强度基本一致，三组间均无明显差异。 利用蛋白质印迹法了解Smoothelin蛋白的表达量的变化。ECL显色，蛋白条带灰度值分析并内参β-actin标准化后，结果提示代偿组的Smoothelin表达量明显上调（4.585±0.0502），而失代偿组的表达明显下降（1.730±0.183），相较于对照组（3.755±0.128），具有统计学显著差异(P＜0.01)。观察Smoothelin蛋白条带在50-70kDa以及100-120kDa两个区段均有强弱不等的显色，符合Smoothelin-A与Smoothelin-B两个亚型的分子量。本实验中β-actin一方面作为内参，另一方面因其作为肌动蛋白同样是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，相较于Smoothelin的明显表达量差异，其各组间其表达量无明显差异。 结论:Smoothelin在糖尿病豚鼠膀胱功能不同阶段表达不同。其表达免疫强度与蛋白表达量在膀胱逼尿肌肌层(MP)均出现代偿期的增高以及失代偿期的下降，并对应尿动力学结果提示的逼尿肌收缩力相同趋势的改变，而微丝肌动蛋白β-Actin的表达量未明显改变，提示Smoothelin作为平滑肌收缩型特异性蛋白，不仅可以特征性表现逼尿肌肌力的改变，而且提示病程中逼尿肌细胞应伴有收缩表型的改变。此外Smoothelin还可能参与其细胞表型的调控。膀胱粘膜下层血管在病程中未出现明显免疫组化改变，提示糖尿病膀胱病变过程中，逼尿肌的功能改变早于血管病变。代偿期粘膜肌层的变薄以及免疫强度改变提示其在逼尿肌肌力改变中可能存在平滑肌细胞增殖以及合成的功能，并调控平滑肌收缩表型以及收缩力的改变。 由此可知，Smoothelin蛋白表达改变所揭示的收缩型逼尿肌减少，以及粘膜肌层的改变，可能是糖尿病膀胱病肌源性病变的重要发病机制。进一步维持逼尿肌收缩表型的数目以及表达，可能是防治糖尿病膀胱病的有效途径之一。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 实验材料及实验方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 技术路线以及实验初步结果

2．3 实验方法

2．3．1 糖尿病豚鼠诱导

2．3．2 尿动力学检查

2．3．3 膀胱组织标本取材

2．3．4 切片制作

2．3．5 免疫组织化学染色(Maxvision法)

2．3．6 蛋白质免疫印迹分析

2．4 数据处理

2．4．1 图像分析

2．4．2 统计学分析

第三章 结果与分析

3．1 豚鼠糖尿病模型的建立

3．1．1 实验豚鼠转归如下

3．1．2 注射STZ前后豚鼠状况

3．2 尿流动力学结果

3．3 免疫组织化学染色检测

3．4 蛋白质印迹法检测

第四章 讨论

4．1 STZ诱导糖尿病豚鼠模型

4．2 糖尿病膀胱病与尿动力学改变

4．3 Smoothelin的表达变化意义及膀胱组织改变

Discussion

结论

展望

参考文献

致谢