东太平洋热液囱硫化物中重金属抗性微生物及南大西洋跨洋中脊表层海水中微生物种群结构分析

摘要

本文通过微生物分离培养和非培养的方法，分析了东太平洋热液烟囱硫化物中重金属抗性微生物的多样性，并对其中一株锌抗性菌株的抗性机制进行了初步研究;同时，详细解析了南大西洋跨洋中脊表层海水中微生物的种群结构。
　　第一部分:东太平洋热液烟囱硫化物中重金属抗性微生物的多样性
　　重金属污染对生态系统和人类健康都构成了巨大威胁，而微生物能通过多种机制对环境中的重金属进行吸附和去除。研究和分析深海热液区多金属硫化物中重金属抗性菌的种群结构及其抗性机制，将为重金属污染生物的修复提供参考。本研究利用七种含有不同种类重金属(Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Hg2+、Co2+和Cr7+)的培养基，对两个来自东太平洋热液烟囱硫化物样品进行了富集，并获得了抗性菌群。PCR-DGGE分析结果表明，Zn、Ni、Mn、Cu、Co和Cr抗性菌群中的优势类群分别是:Halomonas和Paracoccus;Microbacterium和Alcanivorax;Halomonas,Marinobacter和Georgenia;Achromobacter和Serratia;Halomonas和Idiomarina;Idiomarina和Bacillus。
　　利用平板纯培养的方法，从上述富集菌群中分离得到了多种重金属抗性菌，包含16株细菌和8株真菌。16SrRNA基因测序结果表明，这些细菌分属Salegentibacter,Dietzia,Paracoccus,Alcanivorax,Georgenia,Halomonas,Microbacterium，Salinicola和Thalassospira10个属中的13个种。其中，在Zn、Ni、Mn和Co抗性菌群中，PCR-DGGE检测到的优势种属均获得了纯培养，它们分别是HalomonasMicrobacterium和Alcanivorax;Georgenia;Halomonas。另外，从Cu，Co，Zn和Ni抗性菌群中分离获得真菌8株，ITS基因测序结果表明它们均为小红酵母（Rhodotorulaminuta）。
　　随后，我们对分离自Zn抗性菌群且具有较好抗性的菌株VCZn-1进行了研究。该菌株16SrRNA基因序列与模式种HalomonaszinciduransB6T的同源性为100％。生理生化特性研究表明，该菌株最适生长条件为:温度28℃，盐度13％和pH8～9;其对Zn2+的最高抗性为27mmol/L;原子吸收光谱测定结果表明，该菌株3天内，能够促使MA培养基中49±3.42％的Zn2+沉淀。后续Zn2+去除率实验表明，该菌株主要的抗性机制是在稳定期产生的碱性次级代谢物，使培养基的pH值增大，从而导致Zn2+的自然沉淀。此外，该菌株对其它重金属也有较好的抗性，如Mn（9mmol/L），Cu（1mmol/L）和Ni（1mmol/L）。菌株VCZn-1基因组测序结果表明，其基因组大小约3，709，838bp，GC含量为64.04％，在其基因组中存在与重金属抗性相关的ATPase转运体和RND家族转运体，这些抗性基因的存在，可能是该菌株具有多种重金属抗性的分子基础。
　　第二部分:南大西洋跨洋中脊表层海水中微生物的种群结构分析
　　为了解析南大西洋跨洋中脊表层海水中微生物的种群结构，本文利用454焦磷酸测序技术，对横跨南大西洋洋中脊的14个表层海水样品中，细菌和古菌16SrRNA基因的V5～V8区进行了高通量测序。14个样品共获得177，364条序列，其中164，784条有效序列，每个样品平均11，770条序列，序列平均长度约286bp。Shannon和Chao1指数均显示，14个表层海水样品中微生物多样性丰富，且样品间多样性差别不大;Unifrac和UPGMA分析结果表明，14个样品呈现按照采样地理位置进行聚类的趋势，说明它们具有一定的生物地理分布特征。同时，14个样品在微生物组成上并无明显区别，古菌的优势类群为Euryarchaeota中的MarinegroupⅡ和MarineGroupⅢ;而细菌的优势类群为Alpha变形菌纲Rickettsiales目中的SAR11surfacelclade(9.48％～16.19％)，以及Gamma变形菌纲Oceanospirillales目中的SAR86clade(11.93％～18.24％)。在属水平上，14个样品中仅有20.9％～29.1％的序列可分类到属，其中的优势属为:CandidatusPortiera,Alteromonas,Pseudoalteromonas,Fluviicola,Thalassomonas,Oleibacter,Vibrio,Hyphomonas,Alcanivorax和Pelagibaca属。
　　此外，利用富营养的2216E和寡营养的R2A培养基，对水样中好氧细菌进行了分离鉴定。两种培养基共分离获得116株细菌，系统进化分析表明它们分属于Gamma-,Alpha-,Epsilonproteobacteria,Bacteroidetes,Bacilli和Actinobacteria门中的24个属。其中Gammaproteobacteria门是绝对优势类群，占可培养菌株总数的63.79％，它们归属于Vibrio，Pseudoalteromonas，Alteromonas，Marinobacter和Halomonas属;Atphaproteobacteria门占24.14％，主要种属是Erythrobacter，Pseudoruegeria和Sulfitobacter。同时，高通量测序中检测到的Alteromonas，Alcanivorax,Marinobacter,Pelagibaca,Photobacterium,Pseudoalteromonas,Tenacibaculum和Vibrio8个属的细菌，在上述分离培养中均获得了纯培养。
　　综上所述，本文对东太平洋热液烟囱硫化物中重金属抗性微生物及跨南大西洋洋中脊中微生物的种群结构进行研究，并对其中一株重金属抗性菌的抗性机制进行了初步研究。研究结果将有助于对东太平洋热液区中重金属抗性微生物的开发利用，以及对南大西洋表层海水生境中微生物多样性的理解。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 海洋中独特的生态系统-深海热液区

1．2 深海热液区的生物组成

1．3 深海热液区微生物多样性研究的意义

1．4 重金属污染概况

1．5 深海热液区重金属抗性细菌

1．6 微生物对重金属抗性的机制和解毒机理

1．7 本论文的研究思路、目的和意义

第二章 东太平洋热液烟囱重金属抗性微生物多样性

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 热液区重金属抗性菌群的富集及单菌分离鉴定

1．4 重金属抗性菌VCZn-1的鉴定及其锌抗性分析

2 结果与讨论

2．1 硫化物样品元素组成分析

2．2 硫化物样品中微生物种群结构的高通量测序分析

2．3 抗性菌群的富集和抗性菌株的分离鉴定及系统进化分析

2．4 菌群结构DGGE分析

2．5 单菌重金属抗性能力测定

2．6 菌株VCZn-1抗性研究分析

3 小结和展望

第三章 南大西洋跨洋中脊表层海水中微生物种群结构分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与讨论

2．1 表层海水中可培养微生物多样性分析

2．2 表层海水中微生物种群结构的高通量测序分析

3 小结和展望

参考文献

致谢