普威综合症模型Snord116基因敲除小鼠中Snord115超量表达的机制初探

摘要

普威综合症(PWS)是一种复杂的人类遗传性肥胖症。目前认为Snord116是导致PWS最关键的基因。为此实验室前期构建了Snord116敲除小鼠，作为PWS的小鼠模型。PWS基因关键区域约为1000kb，有长的non-coding RNA发挥着重要作用，包括位于下游的Snord115。但这一区域的表达调控机制还不是很清楚。Snord115在成年的野生型小鼠的非神经组织中表达量极其低下，但是在成年Snord116del小鼠的非神经组织中Snord115超量表达。传统上认为SNURF-SNRPN的基因转录是从印迹中心IC起始的，中间没有其他启动子。是否有可能在Snord115区域前存在一个未知的新型启动子，该启动子被激活从而导致了超量表达的现象呢？通过对小鼠基因的分析，我们提出了三种假说，并逐一进行了验证。首先我们假说可能是由于在Snord116del的非神经组织中，Snrpn基因的转录起始效率增强而导致Snord115超量表达。通过对比野生型小鼠和敲除型小鼠的表达情况，发现Snrpn基因的转录起始效率并未增强。第二个假说是有单独的启动子起始Snord115的转录，这一启动子在Snord116del小鼠的非神经组织中活性增强。通过检测敲除型组织中整段序列的表达情况，发现不存在单独的启动子起始Snord115的转录。综合上述现象，第三个假说是Snord116敲除区域在非神经组织中，会阻碍转录延伸的顺利进行，而在Snord116del小鼠该区域的去除导致其下游Snord115的转录增加。通过对敲除区域研究，发现其确实阻碍转录的顺利进行，尤其是非神经组织中弱启动子的转录影响明显。进一步实验对Snord115的拷贝数及稳定性进行分析，发现Snord115在基因组中具有高拷贝数;经actinomycin-D药物处理及RNase消化的实验，发现Snord115具有高度的稳定性，在细胞内几乎不会降解。根据上述结果，我们得出以下结论:在敲除型小鼠的非神经组织中，阻碍转录的因子被敲除，使得Snord115能被顺利的表达。另外，由于Snord115本身的高拷贝数及高度稳定性，使其能够贮积在细胞中不被降解，因此能观察到超量表达的现象。通过对该现象的研究我们对Snrpn基因选择性终止的生物学意义有了更深入的认识;并建立了研究选择性终止机制的新方法，为将来对选择性终止机制进行更深入的研究打下基础。此外，对Snord115的研究，我们认为这种小分子具有被作为鉴定脑损伤的分子指标的潜力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 基因的表达调控方式

1．2 真核生物基因转录终止的研究

1．3 Prader-Willi综合症

1．4 本课题的研究内容与意义

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料、试剂与仪器

2．2 常用溶液配方

2．3 实验方法

第三章 结果与讨论

3．1 Snord116del小鼠的基因结构示意图

3．2 Snord115在Snord116del小鼠的非神经组织中超量表达

3．3 Snord115在Snord116del小鼠非神经组织中超量表达的机制

3．3．1 Snord116del小鼠的非神经组织中，snrpn启动子的起始转录的效率并未增强

3．3．2 snord116del小鼠非神经组织中不存在单独的启动子起始snord115基因转录

3．3．3 成年野生小鼠的非神经组织中敲除区域的存在会阻碍转录的进行

3．4 Snord115拷贝数高并且在细胞内极其稳定

3．4．1 Snord115在基因组中的拷贝数分析

3．4．2 Snord115的稳定性分析

3．5 选择性终止机制研究方法的初探

3．6 讨论

参考文献

致谢