铁、镉及副溶血弧菌胁迫下文蛤铁蛋白在先天性免疫防御中的作用

摘要

文蛤（Meretrixmeretrix）是我国南方沿海地区重要的海水养殖贝类。随着近年来经济的高速发展，日益严重的海洋污染给文蛤养殖业造成了巨大的损失，尤其是病原菌和重金属蓄积所引发的食品安全问题，严重制约了产业的健康可持续发展。因受文蛤基因组信息资源缺乏的影响，至今有关重金属和病原菌对文蛤毒性的作用机制研究相对比较匮乏。本论文以文蛤为实验对象，研究在必须元素铁(Fe)、非必需元素镉(Cd)和副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）分别胁迫下，文蛤铁蛋白在抵抗金属毒性和细菌感染的免疫过程中所产生的重要作用。
　　实验结果表明，在铁浓度为4mg/L和胁迫15天条件下，文蛤鳃、肝胰腺内的铁含量随着胁迫时间增高而呈现上升趋势。在镉浓度0、2、4mg/L和胁迫7天条件下，文蛤肝胰腺和鳃等多种组织内镉含量随镉胁迫浓度增高而呈现上升趋势。在镉胁迫下，分析文蛤肝胰腺组织形态学特征，发现肝胰腺腺上皮细胞增生、肥厚，排列松散，这些现象说明铁、镉不但能够富集于文蛤，并在鳃、肝胰腺组织内累积，而且还能引起组织变异，并通过诱导出多种功能蛋白，影响鳃和肝胰腺执行正常的生理功能。对文蛤鳃和肝胰腺中的铁蛋白、脂多糖诱导肿瘤坏死因子(LITAF)、InhibitorofNF-κB(IκB)、金属硫蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶的表达量进行分析，实验结果表明，在1～4mg/L铁胁迫下，肝胰腺中的铁蛋白表达量随着胁迫浓度增加而增加;并且4mg/L铁胁迫下，随着胁迫时间的延长，肝胰腺中的铁蛋白表达表现为两次上调，而文蛤鳃和肝胰腺中的其他四种蛋白表达均呈现出先上升后下降的趋势，这说明了铁能够引发文蛤的应激反应，使鳃和肝胰腺中转录因子、抗氧化蛋白表达量升高，以消除过量铁对组织造成的毒性和损伤。铁蛋白和环境中铁浓度的正相关性也表明铁蛋白在文蛤铁代谢中发挥了重要作用，铁蛋白变化量可作为检测环境中铁含量的潜在生物标志物。
　　研究5×1011CFU/L副溶血弧菌胁迫96h条件下，文蛤肝胰腺、血细胞、鳃、闭壳肌内铁蛋白、LITAF、IκB、金属硫蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶基因差异表达量均发生变化，但不同组织内的同种蛋白的基因表达模式基本一致，保持先上升后下降的趋势;并且铁蛋白、IκB和谷胱甘肽过氧化物酶在血细胞中的表达量的上调明显高于其他组织。同时，我们发现各蛋白的显著响应时间有明显差异，如LITAF和IκB在3h，铁蛋白在24h，金属硫蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶在48h左右。类似的结果在铁胁迫实验中同样被发现。这表明五种蛋白在抵抗胁迫的免疫防御机制中发挥了不同的生理功能，铁和副溶血弧菌胁迫可能触发了相同的信号通路，铁蛋白是文蛤铁内平衡和先天免疫防御机制中的一个重要中间体。
　　为进一步了解铁蛋白的结构特征，我们克隆了铁蛋白亚基基因，分析其亚基基因的功能位点，并建立系统进化树，结果表明，文蛤铁蛋白具有高度保守性，是一种H型铁蛋白，具有铁氧化中心。以上结果有助于进一步深入探索过量铁的毒性和副溶血弧菌的毒性机理，对于文蛤养殖业中的疾病控制和矿物元素合理使用提供科学依据。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1．铁蛋白概述

1．1．1．铁蛋白结构介绍

1．1．2．铁蛋白的功能

1．1．3．铁蛋白的表达调控

1．2．Fe毒性概述

1．2．1．铁对水生生物的影响

1．2．2．铁对人体危害

1．3．Cd污染概述

1．3．1．镉在体内累积转运途径

1．3．2．镉对水生动物的影响

1．3．3．镉对人体危害

1．4．弧菌的危害

1．5．贝类先天免疫系统

1．5．1．贝类免疫系统概述

1．5．2．铁对免疫系统影响

1．5．3．铁蛋白与先天免疫

1．6．本论文研究的主要内容和意义

2．材料与方法

2．1．材料

2．2．仪器与试剂

2．2．1．主要仪器

2．2．2．主要试剂

2．3．实验方法

2．3．1．镉毒性试验

2．3．2．铁急性毒性试验

2．3．3．副溶血弧菌急性感染实验

2．3．4．ICP-MS测定组织中金属的含量

2．3．5．镉急性胁迫下组织切片观察

2．3．6．荧光定量PCR

2．3．7．重组铁蛋白克隆表达

2．3．8．Western blotting分析

2．3．9．数据分析和生物信息学预测方法

3．结果和讨论

3．1．文蛤铁蛋白的克隆与表达

3．1．1．文蛤铁蛋白基因序列分析

3．1．2．文蛤铁蛋白同源性和进化树分析

3．1．3．重组文蛤铁蛋白表达和纯化

3．1．4．重组铁蛋白的肽质量指纹图谱鉴定

3．1．5．铁蛋白亚基结构

3．2．铁蛋白组织特异性分布

3．3．镉胁迫对文蛤铁蛋白表达量的影响

3．3．1．镉生物累积规律

3．3．2．不同浓度Cd胁迫下文蛤消化腺的组织切片观察

3．3．3．慢性镉盐胁迫下文蛤铁蛋白差异表达

3．4．Fe胁迫下的差异蛋白分析

3．4．1．海水中实际铁含量测定

3．4．2．铁生物累积分析

3．4．3．铁胁迫下铁蛋白的响应分析

3．4．4．Fe胁迫下LITAF响应分析

3．4．5．Fe胁迫下IκB响应分析

3．4．6．Fe胁迫下金属硫蛋白响应分析

3．4．7．Fe胁迫下谷胱甘肽过氧化物酶响应分析

3．5．副溶血弧菌胁迫下的差异蛋白分析

3．5．1．铁蛋白表达差异性分析

3．5．2．LITAF差异表达

3．5．3．IκB差异表达

3．5．4．金属硫蛋白差异表达

3．5．5．谷胱甘肽过氧化物酶差异表达

3．6．假设信号通路图

4．小结

参考文献

6．缩写

在校期间发表论文

致谢