食管鳞癌的体细胞水平基因组变异

摘要

目的:食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是全球常见的致死性恶性肿瘤。为进一步探讨其分子机制，我们利用全基因组外显子测序技术寻找食管鳞癌中多发的突变，包括点突变、结构变异等，并且进一步鉴定食管鳞癌中多发的单核苷酸变异(Single nucleotide variation，SNV)。在体细胞水平探讨食管鳞癌发生发展的分子机制。
　　方法:1.通过外显予测序生成并收集数据库ESCC测序数据。2.128对食管鳞癌外显子测序数据采用新一代基因序列比对方法(Burrows Wheeler Alignment,BWA)进行比对进而运用突变计算软件(Genome Analysis Toolkit，GATK)、(Mutation Detect, MuTect)发现SNV。3.用数学分析方法来识别那些比预计随机发生更加频繁发生突变的基因（Mutation Significance covariates，MutSigCV）进行突变筛选。4.运用R语言统计软件比较SNV计算方法和不同研究发现的SNV。5.用剪接体揭示结构变异算法（Clipping Reveals Structure，CREST）分析ESCC外显子序列结构变异(Structual Variation，SV)。6.对ESCC突变基因进行功能分析(Gene Ontology, GO)。
　　结果:1.外显子测序生成的10对ESCC测序数据，编号为“ZHSHAN10”合并收集的118对ESCC测序数据，编号为“SRP30009”共128对标本的信息。2.128对ESCC测序数据比对和突变计算后发现18863个SNV。3.MutSigCV计算后筛选得到175个突变基因。4.PLEC、EPPK1、N4BP3、KRT35等突变频率较高的多发性点突变基因尚未报道。5.ESCC的PLEC基因突变主要发生在(8q24.3)位置。6.CREST算出1601个结构变异，其中14个结构变异发生频率较高包括:TITIN、MUC16、BRCA1、FAT1、TESK1(＞10％)。7.GO分析得出ESCC的突变基因与RAS家族、细胞周期、钙粘蛋白、网蛋白、蛋白磷酸化、甲基化、锌指结构、G蛋白信号调节、角蛋白相关蛋白、核转录因子、肿瘤坏死因子、凋亡、超激活、染色体开放阅读框等相关。
　　结论:通过分析食管鳞癌的外显子测序数据，在体细胞水平对中国人食管鳞癌的基因组变异进行探讨，并比较不同研究食管鳞癌基因组研究的方法、发现突变的结果等，进而对食管鳞癌多发性点突变、结构变异等信息及其相关的功能通路情况进行分析。为进一步阐明ESCC的分子机制、寻找疾病的治疗靶点奠定了理论基础。

目录

声明

摘要

第1章 前言

第2章 材料、方法和数据分析

2．1 实验材料

2．1．1 组织标本

2．1．2 PCR引物(由上海生工公司合成)

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 数据分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 组织标本DNA提取

2．2．2 基因组DNA的PCR反应

2．2．3 全外显子组建库测序

2．2．4 数据质控流程

2．3 数据分析

2．3．1 测序数据比对与突变计算

2．3．2 突变基因功能注释

2．3．3 突变筛选

2．3．4 突变Sanger法测序验证

2．3．5 结构变异分析

第3章 结果

3．1 收集ESCC标本信息和测序数据

3．2 外显子测序数据质控结果

3．2．1 测序数据统计

3．2．2 数据覆盖度统计

3．3 突变计算参数质量控制

3．4 SNV汇总

3．5 发现的SNV比较

3．5．1 SNV突变计算方法比较

3．5．2 SNV碱基突变分布频率比较

3．5．3 发现的SNV比较

3．5．4 统计比较发现的SNV类型

3．6 SNV Sanger测序验证

3．7 128对ESCC多发点突变基因功能通路

3．8 结构变异算法参数质量控制

3．9 ESCC结构变异

3．9．1 ESCC结构变异汇总

3．9．2 复发频率高于10％的结构变异

第4章 讨论

4．1 ESCC的体细胞水平突变研究情况

4．2 突变研究比较

4．2．1 突变计算方法、发现SNV、碱基突变分布比较

4．3 突变影响的基因

4．3．1 PLEC基因

4．3．2 RAB家族

4．3．3 TPSD1基因

4．3．4 ABCB4基因

4．3．5 GAL3ST3基因

4．3．6 MUC4基因

4．3．7 CTTN基因

4．3．8 PTEN基因

4．4 ESCC多发点突变基因功能通路研究

4．4．1 PI3K／AKT／mTOR信号转导通路与ESCC

4．4．2 EGFR在ESCC中的基础研究

4．4．3 ESCC结构变异

4．5 ESCC体细胞水平基因组变异探讨的临床意义

第5章 结论

参考文献

致谢

硕士期间发表文章

附表