用PEDOT(BSA)复合膜构建新型过氧化氢生物感测器的技术及其性质研究

摘要

在现代医学领域，疾病的预防与诊断方法的研究对人体健康至关重要。传统的临床诊断通常依赖化学和生化手段，操作过程复杂且耗时;有时由于所需程序繁杂以及不可避免的人为错误，使得结果缺少准确性。目前为止，人们正在研究构建生物检测器用于未来的临床诊断，希望一种好的生物检测器应该具有简单、便宜、持久可用甚至易于植入人体等方面的潜力。虽然近年来该领域有了很大的发展，但是在稳定性、灵敏度、可靠性等方面，生物检测器依然在实际应用中面临关键性的技术挑战。因此，构建稳定性好、灵敏度高、持久耐用且具有生物相容性的生物检测器，对人体疾病的预防与诊断具有重要意义。
　　本论文中，我们利用电化学方法将导电高分子聚二氧乙烯噻吩(PEDOT)聚合在Pt表面，同时研究了BSA的添加对PEDOT膜稳定性的影响。然后，将柠檬酸钠还原法制备的纳米金(AuNPs)粒子修饰在PEDOT(BSA)复合膜上，进而以AuNPs对蛋白质的相互作用固定辣根过氧化酶HRP，完成生物检测器的构建。
　　首先，在聚合PEDOT时添加BSA，由于BSA在聚合过程中的模板作用以及对Pt亲疏水性的影响，使得PEDOT(BSA)复合膜比PEDOT膜具有更好的稳定性;而SEM观察结果表明，在正电压条件下，PEDOT(BSA)/Pt对AuNPs的吸附效果较好，最佳吸附电压为+1.0V，此时的最佳吸附时间为1hour。此外，HRP的固定化方法是在室温下将AuNPs/PEDOT(BSA)/Pt电极浸入5g/L的HRP溶液中30min，持续轻微搅拌。
　　其次，我们以循环伏安法，用构建好的HRP/AuNPs/PEDOT(BSA)/Pt电极在磷酸缓冲液(0.1M，pH6.2)中检测不同浓度过氧化氢。结果表明，当扫描范围为-0.2～0.8V，扫描速度为50mV，在电压+0.1V附近有明显的还原峰;且所得阳极电流与对应的过氧化氢浓度之间有良好的线性关系，线性范围为8μM～15mM，检测灵敏度为719.4μA·mM-1·cm-1。
　　再者，当我们向检测溶液中添加50μM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)时，NAD+作为电子传递介体能够显著增强生物检测器的检测灵感度，使其提高35.5％，达到974.84μA·mM-1·cm-1。有趣的是，PEDOT(BSA)/Pt和AuNPs/PEDOT(BSA)/Pt两种电极也对过氧化氢表现出一定的电化学活性，不过NAD+对这两种电极检测灵敏度的促进作用较为微弱。
　　另外，为了探讨Au与PEDOT中S的成键方式，我们用FTIR、XPS以及Raman原位检测PEDOT、PEDOT(BSA)、Au/PEDOT(BSA)三种膜表面化学键组成及变化。结果表明，PEDOT中S是以配位键形式与Au结合，而BSA中S则是以共价键形式与Au结合。
　　总之，本实验制得的HRP/AuNPs/PEDOT(BSA)/Pt生物检测器稳定性好、灵敏度高、可靠性强、具有生物相容性。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 过氧化氢

1．1．1 概述

1．1．2 过氧化氢的性质与结构

1．1．3 过氧化氢的检测

1．2 生物检测器

1．2．1 生物检测器的研究与发展

1．2．2 生物检测器的分类

1．3 过氧化氢生物检测器

1．4 辣根过氧化酶HRP

1．4．1 辣根过氧化酶(HRP)

1．4．2 HRP的结构与性质

1．4．3 HRP的应用

1．4．4 酶固定化方法

1．5 导电高分子PEDOT

1．5．1 PEDOT简介

1．5．2 PEDOT的聚合方法

1．6 纳米金

1．6．1 纳米材料性质

1．6．2 纳米金性质与合成方法

1．7 研究目的及内容

1．7．1 研究目的

1．7．2 研究内容

1．7．3 实验技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．3 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 纳米金AuNPs的制备

2．2．2 蛋白质定性分析

2．2．3 HRP活性分析

2．2．4 Ag／AgCl(aM NaCl)参比电极的制备

2．2．5 工作电极的制备

2．2．6 过氧化氢的CV检测

2．3 分析方法

2．3．1 扫描式电子显微镜SEM

2．3．2 穿透式电子显微镜TEM

2．3．3 表面电位仪Zeta-potential

2．3．4 傅里叶转换红外光谱(FTIR)

2．3．5 化学分析电子能谱仪(XPS)

2．3．6 拉曼光谱仪(Raman)

3 纳米金的制备

3．1 粒径为16nm的AuNPs制备

3．2 AuNPs溶液的UV-VIS扫描

3．3 TEM观察

3．4 不同粒径AuNPs粒子的制备

3．5 小结

4 HRP活性分析

4．1 HRP标准曲线

4．2 HRP生物活性的检测

4．3 小结

5 电极制备与检测性质分析

5．1 PEDOT／Pt制备

5．1．1 PEDOT膜CV聚合及机理分析

5．1．2 PEDOT膜对Pt电极的修饰

5．1．3 Raman分析

5．2 BSA的添加对PEDOT／Pt电极的影响

5．2．1 Pt电极与BSA的亲和性

5．2．2 BSA的添加对PEDOT膜稳定性的影响

5．2．3 最佳BSA添加量

5．3 Au／PEDOT(BSA)／Pt电极的制备

5．4 HRP固定化

5．5 用修饰过的电极检测H2O2

5．5．1 扫描范围的选择

5．5．2 循环伏安法CV检测过氧化氢

5．6 NAD+的添加

5．6．1 最佳NAD+添加量的选择

5．6．2 NAD+的添加对HI冲／AuNPs／PEDOT(BSA)／Pt电极的促进

5．6．3 与NADH的对比

5．6．4 DPV检测

5．7 反应过程扩散类型

5．8 小结

6 对Au-S键结合情况的探讨

6．1 Au-S键结初步讨论

6．2 FTIR分析

6．2．1 样品准备过程

6．2．2 FTIR图谱

6．3 XPS分析

6．3．1 样品准备过程

6．3．2 XPS图谱分析

6．4 Raman分析

6．4．1 样品准备过程

6．4．2 Raman图谱分析

6．5 小结

7 总结与展望

参考文献

硕士在读期间发表成果

致谢