OEA激活PPAR-α和CB2受体减轻TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞相关炎症因子和黏附分子表达的研究

摘要

背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)是由多个因素造成的开始于动脉内膜的一种疾病，现如今As的发病率和致死率逐渐升高，并且发病年龄年轻化。大量的流行病学调查和实验研究证明，高血脂、高血压、吸烟、糖尿病等都是与As发生相关的危险因素，但关于As发生的机制一直众说纷纭，直到1999年，ROSS等提出“As是一种慢性炎症性疾病”的观点，给As的研究带来了一个全新的方向与思路。本论文的研究就是基于这个观点，从炎症反应的角度去探索一种新的、副作用小的抗动脉粥样硬化药物。油酰乙醇胺（N-Oleoylethariolamine，OEA）是大麻素的一种类似物，是PPAR-α受体天然的激动剂之一，最初主要是研究OEA在调节食欲、治疗肥胖症等方面的作用。随后的研究发现，OEA能抑制脂多糖诱导的THP-1细胞的炎症反应。OEA减少ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞的坏死，促进入脐静脉内皮细胞上PPAR-α受体mRNA表达的上调，还具有抑制小鼠巨噬细胞（RAW264.7）C-反应蛋白、TNF-α的分泌。我们实验室前期的研究发现OEA对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞炎症反应有着较明显的保护性效应，但是作用机制目前还不很清楚。故本文的研究目的主要是进一步论证OEA的抗内皮细胞炎症反应的作用及阐明其具体机制。
　　目的:研究OEA对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞炎症反应的保护性作用及OEA发挥作用的相关机制。
　　方法:原代提取培养人脐静脉内皮细胞，给予不同浓度的OEA预保护处理，然后予TNF-α刺激诱导内皮细胞炎症反应，利用酶联免疫吸附试验、Real-time RT PCR、Westem blotting等实验技术检测IL-6、IL-8、VCAM-1、ICAM-1等炎症因子及黏附分子的表达。在同样的处理条件下，分别给予PPAR-α和CB2受体阻断剂，检测IL-6、IL-8、VCAM-1、ICAM-1表达的变化，并进一步探讨OEA发挥抗炎及抗动脉粥样硬化作用的机制。
　　结果:OEA呈浓度依赖性降低TNF-α诱导的HUVECs中IL-6、IL-8、VCAM-1、ICAM-1的表达，当OEA浓度为100μM时效果最明显。分别阻断PPAR-α和CB2受体后，OEA降低IL-6、IL-8、VCAM-1、ICAM-1表达的效应减弱。不同浓度的OEA能激活PPAR-α和CB2受体，降低炎症信号通路分子NF-κB P65的表达，且阻断PPAR-α和CB2受体后，对NF-κB P65抑制作用减弱。另外，不同浓度的OEA对P38 MAPK和p-STAT3等炎症信号分子也有较强的作用。
　　结论:OEA对TNF-α诱导的HUVECs炎症反应有保护性作用，能够明显降低相关炎症因子及黏附分子的表达。OEA的抗炎及抗As作用和PPAR-α和CB2受体密切相关，这对进一步研究OEA作为一种新的预防及治疗As有一定的指导意义。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 动脉粥样硬化与炎症

1．1．1 As影响因素与发病机制学说

1．1．2 As与炎症

1．1．3 与As相关的炎症信号通路及信号转导分子

1．2 PPAR-α简介及其与动脉粥样硬化的关系

1．2．1 过氧化物酶体增殖物激活受体概述

1．2．2 PPAR-α在As中的作用

1．3 大麻素受体简介及其与动脉粥样硬化的关系

1．3．1 大麻素受体简介

1．3．2 大麻素受体与As

1．4 OEA概述

1．4．1 OEA来源及其合成与分解代谢

1．4．2 OEA的作用及其对As的影响

1．5 本论文的主要研究内容和意义

第二章 人脐静脉内皮细胞的分离、培养与鉴定

2．1 脐静脉内皮细胞提取分离与传代培养

2．1．1 实验仪器及部分实验试剂

2．1．2 主要试剂配制

2．1．3 脐静脉内皮细胞提取前准备

2．1．4 人脐静脉内皮细胞的分离提取

2．1．5 HUVECs的传代培养

2．2 人脐静脉内皮细胞的鉴定

2．2．1 HUVECs的形态学鉴定

2．2．2 HUVECs的Ⅷ因子相关抗原检测

2．3 实验结果及讨论

2．3．1 HUVECs形态学观察

2．3．2 免疫组织化学染色鉴定结果

2．4 本章小结

第三章 不同浓度OEA对TNF-α诱导的HUVECs相关炎症因子和黏附分子表达的影响

3．1 实验仪器和部分试剂

3．2 部分实验试剂的配制

3．3 实验方法

3．3．1 细胞活性检测

3．3．2 基因水平检测的给药方法

3．3．3 蛋白水平检测的给药方法

3．3．4 细胞总RNA提取及含量测定

3．3．5 逆转录，cDNA的合成

3．3．6 引物的设计与合成

3．3．7 聚合酶链式反应(PCR)

3．3．8 酶联免疫吸附试验

3．3．9 Western Blot实验方法

3．4 统计学处理

3．5 实验结果及讨论

3．5．1 细胞活性检测结果

3．5．2 不同浓度OEA下调TNF-α诱导的HUVECs IL-6、IL-8 mRNA水平

3．5．3 不同浓度OEA减轻TNF-α诱导的HUVECs中IL-6、IL-8蛋白的分泌

3．5．4 不同浓度OEA降低TNF-α诱导的HUVECs黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表达

3．6 本章小结

第四章 不同浓度OEA对TNF-α刺激下HUVECs上PPAR-α和CB2受体表达的影响

4．1 实验仪器及部分试剂

4．2 实验方法

4．2．1 基因水平检测的细胞给药

4．2．2 蛋白水平检测的细胞给药

4．2．3 细胞总RNA提取及含量测定

4．2．4 逆转录，cDNA的合成

4．2．5 引物的设计与合成

4．2．6 聚合酶链式反应(PCR)

4．2．7 Western Blot实验方法

4．3 统计学处理

4．4 实验结果及讨论

4．4．1 不同浓度OEA上调TNF-α诱导的HUVECs上PPAR-α、CB2 mRNA水平

4．4．2 不同浓度OEA上调TNF-α诱导的HUVECs上PPAR-α、CB2蛋白的表达

4．5 本章小结

第五章 OEA减轻TNF-α诱导的HUVECs炎症反应机制的探究

5．1 实验所需仪器和实验试剂

5．2 实验方法

5．2．1 基因水平检测的给药方法

5．2．2 蛋白水平检测的给药方法

5．3 统计学处理

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 阻断PPAR-α和CB2受体后IL-6及IL-8 mRNA表达上调

5．4．2 阻断PPAR-α和CB2受体后HUVECs培养上清液中IL-6及IL-8蛋白含量升高

5．4．3 阻断PPAR-α和CB2受体后黏附分子VCAM-1、ICAM-1表达上调

5．5 本章小结

第六章 OEA激活CB2和PPAR-α受体后抑制NF-κB的激活

6．1 实验仪器及部分试剂

6．2 实验方法

6．3 统计学处理

6．4 实验结果

6．4．1 阻断CB2受体后并不影响HUVECs上PPAR-α受体的表达

6．4．2 不同浓度OEA抑制TNF-α诱导的NF-κB蛋白激活

6．4．3 OEA抑制TNF-α诱导的NF-κB蛋白激活和CB2及PPAR-α受体有关

6．5 本章小结

第七章 OEA对P38-MAPK和STAT3信号通路的影响

7．1 实验仪器及部分试剂

7．2 实验方法

7．2．1 蛋白水平检测的细胞给药方法

7．2．2 Western Blot实验方法

7．3 统计学处理

7．4 实验结果

7．4．1 不同浓度OEA抑制磷酸化P38-MAPK信号的激活

7．4．2 不同浓度OEA抑制磷酸化STAT3蛋白信号的激活

7．5 本章小结

第八章 结论与展望

缩略语表

附录 硕士期间发表的学术论文

参考文献

致谢