IL-20相关因子在小鼠免疫性心肌炎中的作用及机制研究

摘要

目的:免疫相关因素与心肌炎引起的心肌纤维化密切相关。前期研究表明，IL-10家族成员在心肌炎慢性期心肌纤维化的形成过程中发挥重要作用。IL-20是最新发现的IL-10家族成员之一，具有调节细胞增殖和分化的作用。但IL-20是否参与心肌炎心肌纤维化过程尚不清楚。本课题通过实验探讨IL-20及其相关因子对小鼠自身免疫性心肌炎(EAM)心肌纤维化的影响及可能的分子调节机制。
　　方法:利用小鼠心肌肌球蛋白多肽MyHC614-629和完全弗氏佐剂充分混合后，于第0天和第7天皮下注射建立小鼠EAM模型;组织切片H&E染色及Masson染色评估心肌组织炎症及纤维化程度;Realtime PCR及Western blot检测IL-20家族因子及其受体在心肌组织中EAM不同时程的表达变化;免疫荧光确定IL-20受体在心肌组织中的分布状态;在体外实验，利用CCK-8法检测IL-20家族因子对心肌成纤维细胞增殖活性的影响，并初步探讨其调节心肌纤维化的可能分子机制。
　　结果:在体内实验中，EAM小鼠2周时心肌组织可见少量炎性细胞浸润;3周时心肌组织炎性细胞浸润及组织损伤明显加重;4周时心肌组织炎症反应明显减轻，少量胶原纤维形成;2月时心肌间质胶原纤维大量沉积，形成以心肌纤维化为主的病理过程。IL-20相关因子及其受体的表达与心肌纤维化程度呈正相关，其受体之一主要分布于心肌间质的成纤维细胞。在体外实验中，IL-20促进了小鼠原代心肌成纤维细胞(PCF)和心肌成纤维细胞系(L-929)的增殖活性增加，并引起其受体表达上调;其下游信号通路的Stat3磷酸化增加，mTOR的蛋白表达量相应增加;另外，IL-20也可促进Menin蛋白表达量增加，且在Menin-/-成纤维细胞中，IL-20的对成纤维细胞的促增殖作用明显减弱。
　　结论:IL-20参与EAM小鼠心肌纤维化的形成过程，其分子机制可能通过与受体结合，诱导Stat3磷酸化，并可促进mTOR和Menin蛋白表达，进而调节心肌成纤维细胞的增殖及纤维化的形成。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 心肌炎及心肌纤维化

1．1．1 心肌炎病理过程及免疫应答

1．1．2 心肌纤维化及免疫机制研究进展

1．2 白细胞介素20

1．2．1 Th2细胞及IL-10家族因子

1．2．2 IL-20亚家族因子及受体

1．2．3 IL-20下游通路

1．2．4 IL-20亚家族因子生物学功能

1．3 心肌纤维化与mTOR

1．4 各器官纤维化与Menin的关系

1．5 课题构思

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验设备及耗材

2．1．4 主要溶液的配置

2．2 实验方法

2．2．1 小鼠EAM动物模型的建立

2．2．2 器械准备

2．2．3 心脏组织的收集

2．2．4 心脏组织的包埋与冰冻

2．2．5 冰冻切片的制备

2．2．6 HE染色

2．2．7 Masson染色

2．2．8 免疫荧光染色

2．2．9 成纤维细胞的培养

2．2．10 细胞增殖检测实验(CCK-8实验)

2．2．11 细胞的冻存以及冻存细胞的复苏

2．2．12 蛋白质提取

2．2．13 蛋白浓度检测(Bradford法)

2．2．14 应用Western Blotting技术检测

2．2．15 组织样本RNA提取(Trizol法)

2．2．16 RNA浓度、纯度测定及逆转录

2．2．17 PCR

2．2．18 Real Time PCR

2．2．17 数据统计分析

第三章 实验结果

3．1 IL-20在小鼠EAM不同时程中的表达

3．1．1 EAM小鼠各时程心肌组织病理特征分析

3．1．2 IL-20家族因子在小鼠EAM慢性期心脏组织中的表达水平

3．1．3 小鼠EAM时程中IL-20相关受体表达水平变化

3．1．4 IL-20受体IL-22Ra亚基在心脏组织中的分布

3．2 IL-20对心肌成纤维细胞的增殖作用

3．2．1 IL-20促进原代心肌成纤维细胞增殖的剂量及时间依赖性

3．2．2 IL-19／IL-24对心肌成纤维细胞增殖的影响

3．2．4 IL-20对成纤维细胞系L-929细胞的增殖作用

3．3 初步探究IL-20促进增殖活性的作用机制

3．3．1 IL-20对其受体的表达影响

3．3．2 IL-20诱导Stat3磷酸化信号通路

3．3．3 Menin在EAM慢性期的表选及与促增殖相关作用机制

3．3．4 心肌成纤维细胞转化机制探讨

第四章 讨论

附录

参考文献

致谢

主要科研成果