APR-246/PRIMA-1MET对人结膜鳞状上皮化生的影响及相关机制

摘要

目的：探讨APR-246/PRIMA-1 MET对人结膜鳞状上皮化生(squamousmetaplasia，SM)的影响及研究其相关作用机制。
　　方法：结膜组织以不同浓度的APR-246/PRIMA-1 MET(0μM，3μM，15μM)空气暴露培养不同时间（4，8，12天）。HE染色检测结膜上皮的形态改变;免疫组织化学染色检测结膜上皮特异性功能相关基因的表达;实体显微镜观察测算结膜周边新生上皮细胞的数量和速度;免疫荧光染色和实时荧光PCR检测上皮增殖及分化状态和Wnt信号通路相关基因的表达。
　　结果：HE染色实验显示15μM APR-246/PRIMA-1MET处理可显著抑制空气暴露条件下结膜上皮复层化及上皮细胞层数增加。实体显微镜观察发现3μM和15μM APR-246/PRIMA-1MET均可抑制结膜上皮周边细胞的生长数量及迁移速度。免疫组织化学染色和实时荧光PCR检测表明，空气暴露培养可上调结膜上皮增殖相关基因p63并诱导皮肤特异性角蛋白K10的表达，降低黏蛋白MUC5AC和眼部关键转录调控因子Pax6的表达，而APR-246/PRIMA-1 MET在不同程度上对上述蛋白的异常表达有所纠正。胬肉组织中，运用APR-246培养发现胬肉上皮细胞层数减少，皮肤特异性角蛋白K10及增殖相关基因p63表达量下降，上皮形态趋向正常结膜表型。免疫荧光染色还发现APR-246/PRIMA-1MET可显著提降低β-catenin入核比率，实时荧光PCR检测Wnt/β-catenin信号通路下游基因TCF-4的mRNA水平较对照组明显下降，提示APR-246/PRIMA-1MET作用可能与抑制Wnt信号通路活化相关。
　　结论：APR-246/PRIMA-1 MET可抑制体外空气暴露诱导的结膜鳞状上皮化生改变，有望用于眼表鳞状上皮化生类疾病的临床治疗。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第一章 前言

1．1 鳞状上皮化生

1．1．1 鳞状上皮化生的概述

1．1．2 眼表上皮细胞鳞状上皮化生的研究历史

1．1．3 眼表上皮细胞鳞状上皮化生的模型

1．1．4 眼表上皮细胞鳞状上皮化生发生的相关因子

1．1．5 眼表鳞状上皮化生发生的相关信号通路

1．1．6 眼皮鳞状上皮化的治疗

1．2 p63基因

1．2．1 p63基因的结构及功能

1．2．2 p63基因与疾病

1．3 APR-246／PRIMA-1Met的结构及相关研究

第二章 实验材料

2．1 组织材料的选择

2．1．1 结膜

2．1．2 胬肉

2．2 主要抗体

2．3 试剂和药品

2．4 主要实验仪器和耗材

2．5 试剂配制

2．5．1 SHEM上皮培养基的配置

2．5．2 PRIMA-1MET／APR-246溶液的制备

2．5．3 10xPBS缓冲液的制备

2．5．4 组织染色相关溶弃J配置

2．6 主要应用软件

第三章 实验方法

3．1 人结膜组织的空气暴露培养

3．2 人胬肉组织的培养

3．3．冰冻切片的制备

3．4 HE染色

3．5 免疫酶组织化学染色法

3．6 免疫荧光组织化学染色法

3．7 实时荧光PCR

3．7．1 总RNA的提取

3．7．2 逆转录

3．7．3 引物序列

3．7．4 实时荧光定量PCR

3．7．5 熔解曲线

3．8 图像分析

3．9 统计学分析

第四章 结果与分析

4．1 APR-246对人结膜体外鳞状上皮化生的影响

4．1．1 APR-246对结膜组织上皮形态学的影响

4．1．2 APR-246对结膜组织上皮细胞分化的影响

4．1．3 APR-246对结膜组织上皮细胞增殖的影响

4．2 APR-246对胬肉上皮异常表型的回复作用

4．2．1 APR-246对胬肉组织上皮形态的影响

4．2．2 APR-246对胬肉上皮细胞异常分化的影响

4．2．3 APR-246对胬肉上皮细胞异常增殖的影响

4．3 APR-246抑制结膜鳞状上皮化生的机制

第五章 讨论

5．1 APR-246对结膜上皮细胞谱系分化的影响

5．2 APR-246抑制结膜上皮鳞状化生的机理

5．3 APR-246对翼状胬肉的潜在治疗作用

第六章 结论

参考文献

致谢