结核分枝杆菌反式翻译过程关键蛋白SmpB的生化性质和溶液结构研究

摘要

反式翻译是结核分枝杆菌体内唯一的核糖体拯救机制，与细菌生存和繁殖密切相关。SmpB蛋白是反式翻译核心分子tmRNA的重要伴侣分子，它可以与tmRNA特异性结合，并与tmRNA活性的发挥密切相关，可作为高通量筛选新型抗结核药物的潜在靶点。因此，研究结核分枝杆菌反式翻译过程中的SmpB蛋白(MtSmpB)的三维结构和动力学特征，对设计和研发新型抗结核药物有着重要的研究意义。
　　本论文，我们首先利用基因克隆技术，构建了含有不同片段长度的MtSmpB基因的重组子，经过大量的表达纯化条件筛选和优化，最终成功制备了MtSmpB（10-154）蛋白及其N-terminal结构域(MtSmpBNTD)蛋白。远紫外CD光谱实验结果显示MtSmpB蛋白的二级结构以β-sheet为主，全长的MtSmpB与MtSmpBNTD相比无归卷曲含量明显增加，推测MtSmpB羧基端在溶液中可能以无规卷曲的构象存在，与文献报道的大肠杆菌和嗜热菌SmpB蛋白的N-terminal结构相类似。我们还利用圆二色谱实验对MtSmpBNTD二级结构的稳定性进行了研究:尿素诱导的去折叠过程表明MtSmpBNTD蛋白在尿素溶液中的Gm值为3.015±0.133M，在低浓度变性剂存在时二级结构就会发生明显改变;热诱导的去折叠过程表明其Tm值为76.540±0.013℃，温度高于70℃时二级结构才会发生去折叠。
　　此外，我们制备了15N和13C双标记的MtSmpBNTD蛋白样品，并在Bruker AvanceⅢ850MHz核磁谱仪上采集了一系列的2D和3D NMR谱，用于MtSmpBNTD蛋白的主链和侧链原子的化学位移指认和结构计算。利用Sparky软件我们已经完成了95％的主链氨基酸序列认证和85％以上的侧链原子化学位移指认。用CSI法预测该蛋白二级结构以β-折叠为主，与CD实验结果一致。由于一些氨基酸残基化学位移的简并，增加了谱峰指认的难度，影响了结构计算的进度，但是初步计算结果表明MtSmpBNTD蛋白折叠正确。下一步我们将参考同源模建的三维结构完成MtSmpBNTD蛋白溶液结构的计算工作。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 结核病概况

1．1．1 结核分枝杆菌的生物学性状

1．1．2 结核病疫情现状

1．2 反式翻译过程

1．3 SmpB蛋白

1．3．1 SmpB蛋白的功能

1．3．2 SmpB同源蛋白的结构

1．4 核磁共振技术在蛋白质结构研究中的应用

1．5 本课题的研究目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株及载体信息

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 主要仪器

2．2 常用试剂的配制

2．2．1 基因克隆和蛋白表达试剂的配制

2．2．2 蛋白纯化试剂的配制

2．2．3 凝胶电泳试剂的配制

2．2．4 蛋白稳定性及均一性考查相关缓冲液的配制

2．3 实验方法

2．3．1 MtsmpB重组质粒的构建

2．3．2 突变体的构建

2．3．3 重组质粒的转化

2．3．4 重组蛋白的表达

2．3．5 重组蛋白的纯化

2．3．6 蛋白质的检测和定量

2．3．7 MtsmpB缓冲液的筛选

2．3．8 动态光散射技术分析蛋白质聚集状态

2．3．9 圆二色谱分析

2．3．10 同位素标记样品的制备

2．3．11 NMR实验和数据处理

2．3．12 主链序列认证

2．3．13 侧链化学位移的指认和NOE信号的归属

2．3．14 二级结构预测

2．3．15 溶液结构的计算

2．3．16 MtsmpB蛋白晶体的制备

3 结果与讨论

3．1 13个截短型MtSmpB蛋白的表达纯化及表征

3．1．1 13个截断型重组质粒的构建

3．1．2 重组蛋白的小量表达

3．1．3 MtSmpB4／28a的大量表达与纯化

3．1．3 MtSmpB4／28a的二级结构分析

3．1．4 MtSmpB4／28a的2D NMR实验

3．2 12个截短型MtSmpB蛋白的表达纯化及表征

3．2．1 12个截断型重组质粒的构建

3．2．2 重组蛋白的小量表达

3．2．3 重组蛋白大量表达与纯化

3．2．4 MtSmpB18／28a的二锻结构分析

3．2．5 MtSmpB18／28a的1D和2D NMR实验

3．2．6 MtSmpB蛋白晶体的制备

3．3 突变体的构建及稳定性分析

3．4 MtSmpBNTD的溶液结构的研究

3．4．1 MtSmpBNTD克隆与载体构建

3．4．2 MtSmpBNTD蛋白重组质粒的小量表达

3．4．3 MtSmpBNTD蛋白的大量表达与纯化

3．4．4 MtSmpBNTD蛋白的稳定性及均一性检测

3．4．5 MtSmpBNTD蛋白的结构稳定性分析

3．4．6 MtSmpBNTD蛋白共振信号的指认

3．4．7 MtSmpBNTD蛋白的二级结构预测

3．4．8 MtSmpBNTD蛋白的溶液结构计算

4 小结

参考文献

附录

发表论文

致谢