非梗阻性无精少精症主要遗传因素的快速检测新方法研究

摘要

研究目的:建立一种基于实时荧光PCR(Real-time PCR)平台的检测新技术，能够在一个反应管内快速准确地同时检测克氏综合征与Y染色体微缺失。从而建立一种廉价、易行、高通量的针对非梗阻性无精少精症的主要遗传因素检测新方法，为男性不育的科学治疗与预后提供有效的指导工具。以多重实时荧光PCR技术在克氏综合征与Y染色体微缺失检测中的临床应用评估。并探讨厦门地区克氏综合征与Y染色体微缺失发病情况。
　　研究方法:分别针对Y染色体上ZFY、AZFa、AZFb、AZFc四个区域内的目标序列设计四对检测引物与对应的四条检测探针。四条探针分别采用FAM、HEX、ROX和CY5荧光基团标记，通过实时PCR反应，建立可在单一个反应管内同时对克氏综合征与Y染色体微缺失进行双重验证的四重PCR反应体系。应用多重实时荧光PCR技术，对1624例就诊我院的非梗阻性无精少精症患者，进行克氏综合征以及AZFa，AZFb，AZFc区共六个序列标记位点(STS)的微缺失分析，结果与对照方法进行比较。
　　研究结果:成功建立检测克氏综合征与Y染色体微缺失的四重PCR反应体系。同时它们均具有高诊断率及良好的灵敏度和特异性。在克氏综合征(47，XXY)和正常男性(46，XY)的模板DNA在2ng到100ng之间时，NRP值是无重叠的。因此，检测47，XXY的四重试验法，对基因组DNA模板量应用范围较宽，其检测最低量为2 ng。此外，我们发现25ng的DNA是检测克氏综合征的最佳模板量。以多重实时荧光PCR技术检测克氏综合征的患病率为3.33％;Y染色体微缺失的患病率为5.23％。在AZF缺失的各类型比较中，以AZFc区微缺失占的比例最高为61.18％，其次为AZFb+c区微缺失占的比例为22.35％。
　　研究结论:我们构建的克氏综合征和Y染色体微缺失与四重PCR结合的检测方法，实现了快速、准确、廉价的特点。能避免琼脂糖凝胶电泳分析方法所遇到的PCR产物的污染，同时与现有的分子的方法，如染色体微数组分析(CMA)，下一代测序(NGS)，荧光定量PCR(QF-PCR)等相比，不但可显着降低操作过程的时间，也可明显降低实验耗费，实验结果可靠性高，使克氏综合征和Y染色体微缺失的分子检测更加经济有效。多重实时荧光PCR技术应用于克氏综合征和Y染色体微缺失的检测技术实现了快速、准确、高通量的检测优点，为日后检测非梗阻性无精少精症遗传因素方面提供良好的检测平台。

目录

声明

摘要

前言

1．1 非梗阻性无精少精症及其遗传学基础

1．2 克氏综合征与Y染色体微缺失检测的意义

参考文献

第一章 克氏综合征与Y染色体微缺失的检测方法进展

参考文献

第二章 克氏综合征与Y染色体微缺失的快速检测新方法研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂与设备

2．1．3 抽提血液样本基因组DNA与定量

2．1．4 引物、探针的设计与制备

2．1．5 多重PCR反应

2．1．6 针熔解曲线检测

2．1．7 评估四重试验分析灵敏度和特异性

2．1．8 评估四重试验诊断的灵敏度和特异性

2．1．9 实验数据分析

2．1．10 实验整体设计

2．2 结果

2．2．1 多重实时荧光PCR技术在克氏综合征与Y染色体微缺失患者中染色体数目异常的分析灵敏度与特异性

2．2．2 多重实时荧光PCR技术在克氏综合征与Y染色体微缺失患者中染色体数目异常的诊断灵敏度与特异性

2．3 讨论

参考文献

第三章 克氏综合征与Y染色体微缺失的快速检测新方法临床应用与评估

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 克氏综合征与Y染色体微缺失的患病率

3．2．2 讨论

参考文献

在学期间科研成绩

致谢