原发干燥综合征小鼠模型发病前相关致病机制的研究

摘要

目的:
　　原发干燥综合征是一种累及唾液腺和泪腺从而导致口干和眼干的自身免疫性疾病。目前，该疾病的发病机制还不明确，尤其是该疾病在临床症状出现之前的相关发病因素更不清楚。研究表明，和该疾病相关的抗SSA(Ro60)抗体早在患者出现临床症状几年之前就已出现，说明该抗体可能直接或间接参与到了原发干燥综合征的早期发病机制中。最近，我们通过免疫一段Ro60多肽建立了一种新的小鼠模型。在这个模型里，小鼠首先产生抗SSA(Ro60)抗体，然后出现外分泌腺腺体淋巴细胞浸润和泪腺分泌功能受损，这一现象很好地模拟了病人的情况。在这一项研究里，为了研究原发干燥综合征临床症状出现之前的早期发病机制，我们对这种小鼠模型发病之前的早期阶段进行研究。
　　方法:
　　我们给实验组小鼠免疫Ro60_316-335+TiterMax，给对照组小鼠免疫PBS+TiterMax。并且收集免疫前、免疫后第2周、4周、6周和12周小鼠的血清、泪腺和腮腺腺体以作进一步研究。为了界定疾病发病之前的早期阶段，我们检测小鼠在免疫前和免疫后各个时间点的自身抗体产生、腺体淋巴细胞浸润和泪液分泌情况。为了了解疾病发病早期阶段在泪腺中发生的生物学反应，我们检测小鼠发病前泪腺中的全基因组表达水平的变化。随后，我们对可能与致病相关的基因的表达的变化在RNA水平和蛋白水平上进行确认。为了了解泪腺腺体中的细胞凋亡情况，我们使用TUNEL方法来检测细胞核中可能存在的由细胞凋亡导致的断裂的DNA。此外，为了观察CD4+T淋巴细胞在小鼠致病过程中的作用，我们在免疫Ro60_316-335+TiterMax后给小鼠注射抗CD4单克隆抗体来敲除CD4+T淋巴细胞，观察小鼠的疾病发展情况。
　　结果:
　　小鼠在免疫2周后开始产生针对Ro60_316-335的自身抗体，并且逐渐开始出现抗原表位扩展;免疫4周后，小鼠泪腺中开始出现T淋巴细胞浸润;免疫12周后，小鼠出现泪液分泌减少的症状。因此，我们将免疫后前六周定义为小鼠模型的发病早期阶段。基因表达图谱分析发现:小鼠免疫Ro60_316-335+TiterMax或PBS+TiterMax后两周的泪腺细胞中的MHCⅡ基因的表达相对于免疫前要明显升高;小鼠免疫Ro60_316-335+TiterMax后两周的泪腺细胞的核代谢相关基因的表达比PBS+TiterMax免疫的对照组明显降低。免疫荧光和免疫组化实验均显示，在小鼠泪腺组织里的腺泡细胞和导管细胞表面存在有MHCⅡ分子的异位表达，并且表达有MHCⅡ分子的细胞还与CD4+T淋巴细胞之间存在直接接触。另外，细胞凋亡的相关基因的表达在Ro60316-335免疫的小鼠泪腺里没有明显升高，而且细胞凋亡在免疫小鼠和对照小鼠的泪腺里也没有显著的差异。最后，小鼠在免疫Ro60316-335+TiterMax后，敲除CD4+T淋巴细胞可防止小鼠的泪液分泌的降低。
　　结论:
　　我们通过对这个新的小鼠模型的研究发现，在临床症状出现前的早期阶段的泪腺中有两个免疫相关反应出现，分别是TiterMax诱导的MHCⅡ分子在泪腺组织细胞上的异位表达和Ro60_316-335多肽免疫诱导的核代谢相关基因表达的降低。这些证据说明这两个因素可能参与了这个小鼠模型的的早期发病机制。同时，我们的研究发现CD4+T淋巴细胞在小鼠发病机制中有着不可或缺的作用，但细胞凋亡不太可能是这个小鼠模型里的早期发病因素。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 原发干燥综合征

1．1．1 基本概况

1．1．2 诊断标准

1．1．3 治疗

1．2 原发干燥综合征发病机制的研究

1．2．1 T淋巴细胞

1．2．2 B淋巴细胞

1．2．3 上皮细胞

1．2．4 细胞凋亡

1．2．5 遗传因素

1．2．6 环境因素

1．3 原发干燥综合征发病前相关致病因素的研究现状

1．4 研究目的

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验器材

2．1．3 实验试剂

2．1．4 溶液的配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 动物实验

2．2．2 组化实验(HE染色)

2．2．3 免疫荧光实验

2．2．4 免疫组化实验

2．2．5 ELISA实验(酶联免疫吸附实验)

2．2．6 western-Blot实验

2．2．7 RT-PCR(实时定量逆转录PCR)

2．2．8 CD4+T细胞敲除实验

第三章 结果

3．1 界定小鼠模型的发病早期阶段

3．1．1 小鼠模型的泪液分泌

3．1．2 小鼠模型的自身抗体的产生

3．1．3 小鼠模型的泪腺中的T淋巴细胞浸润

3．2 小鼠泪腺腺体的基因表达图谱

3．2．1 基因表达图谱实验计划

3．2．2 小鼠免疫后第六周泪腺组织中的差异表达基因

3．2．3 小鼠免疫后第二周泪腺组织中的差异表达基因

3．2．4 RT-PCR验证基因表达图谱结果

3．3 小鼠泪腺腺体组织细胞上MHC Ⅱ蛋白分子的表达

3．3．1 MHC Ⅱ蛋白分子在泪腺中的表达

3．3．2 泪腺中MHC Ⅱ蛋白分子的表达细胞的鉴定

3．3．3 TiterMax诱导MHC Ⅱ蛋白分子表达的特异性

3．4 细胞凋亡在小鼠模型发病机制中的作用

3．4．1 细胞凋亡相关基因的表达

3．4．2 小鼠泪腺组织中的细胞凋亡情况

3．5 CD4+T淋巴细胞在小鼠模型致病机制中的作用

3．5．1 表达MHC Ⅱ分子的泪腺腺体细胞与CD4+T淋巴细胞直接接触

3．5．2 CD4+T淋巴细胞敲除后小鼠外周血中的CD4+T淋巴细胞

3．5．3 CD4+T淋巴细胞敲除后小鼠的泪液分泌的变化

3．5．4 CD4+T淋巴细胞敲除后小鼠体内自身抗体的产生

第四章 讨论

4．1 T细胞免疫反应在原发干燥综合征发病中的作用

4．2 小鼠泪腺组织细胞上的MHC Ⅱ分子的异位表达

4．3 泪腺组织细胞核代谢相关基因低表达的作用

4．4 细胞凋亡在原发干燥综合征发病中的作用

第五章 总结和展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

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