半纤维素酶基因的克隆表达及协同酶解竹半纤维素的研究

摘要

半纤维素结构成分复杂，除了由木聚糖、甘露聚糖等组成的主链外，还含有不同侧链取代基，如D-半乳糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸等。因此半纤维素的彻底降解需要多种酶的协同作用。本课题组已经从黑曲霉BE-2中表达了阿拉伯糖苷酶。本论文从东方肉座菌EU7-22中克隆表达了GH10家族的木聚糖酶，同时还从A.niger BE-2中克隆并表达了GH67家族α-葡萄糖醛酸酶，并利用这两种酶和阿拉伯糖苷酶对竹屑半纤维素进行协同酶解研究。主要结果如下:
　　(1)从东方肉座菌EU7-22中首次成功克隆获得了一GH10家族的木聚糖酶基因xynⅢ,成功构建了木聚糖酶Ⅲ重组菌并实现了其在毕赤酵母中的高效表达，该重组菌株在诱导培养168 h后粗酶液的木聚糖酶可达到127.5 IU/mL。该酶催化最适pH为6.0，最适反应温度为65℃，在50℃下热稳定性较好;该酶对小麦阿拉伯木聚糖(WAX)、山毛榉木聚糖(BWX)和燕麦木聚糖(OSX)具有较高的酶活性以及亲和力，其底物特异性酶活分别为582 IU/mg、450 IU/mg和405 IU/mg酶蛋白。
　　同时研究了木聚糖酶XYNⅢ对低聚木糖的作用方式，该酶能够将木三糖、木四糖、木五糖以及木六糖均降解为木糖和木二糖，但不能作用于木二糖。通过XYNⅢ降解BWX和OSX的研究发现，XYNⅢ能够水解木聚糖为木糖和木二糖，但不能作用于带有侧链的低聚木糖。
　　(2)从黑曲霉A.niger BE-2中克隆得到了一GH67家族α-葡萄糖醛酸酶基因gus67，该基因全长2466 bp，编码821个氨基酸。生物信息学分析表明，该基因与与黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88α-葡萄糖醛酸酶基因(accessionnumber: XM_001401166.1)和Aspergillus niger的aguA基因（accession number:AJ290451.1）的同源性达到99％;该基因编码的蛋白GUS67理论分子量为91.61kDa，理论等电点为5.1，为亲水性蛋白。
　　构建了α-葡萄糖醛酸酶基因(gus67)的毕赤酵母表达菌株GS115(pPIC9K-gus67)，并实现了其在毕赤酵母中的异源表达。诱导表达产物的SDS-PAGE图显示在约130 kDa处有条带，同时利用该酶水解4-O-甲基葡萄糖醛酸低聚木糖，结果证明了该酶具有α-葡萄糖醛酸酶活性。
　　(3)从竹屑中提取了半纤维素并表征了其结构组成。半纤维素提取率为19.24％;结构表征分析得出该半纤维素为聚-L-阿拉伯糖-（4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸）-乙酰基-D-木糖;定量分析了竹屑半纤维素的糖组分:木糖、阿拉伯糖、葡萄糖以及糖醛酸的含量分别为79.88％、5.06％、1.13％和7.71％。
　　(4)研究了半纤维素酶协同降解竹半纤维素的效果。当反应条件相同时，木聚糖酶(XYNⅢ)与α-葡萄糖醛酸酶(GUS67)和阿拉伯糖苷酶(AnAxh62A)与进行联合酶解或协同降解竹半纤维素的低聚木糖产率，均比木聚糖酶XYNⅢ单独酶解竹半纤维素的低聚木糖产率高。其中当利用XYNⅢ先酶解半纤维素再利用GUS67和AnAxh62A协同酶解再用XYNⅢ降解，其低聚木糖和木糖的产率可达65％。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 可再生资源——生物质

1．2 半纤维素的结构及其降解酶系

1．2．1 半纤维素的结构及组成

1．2．2 半纤维素降解酶概述

1．3 内切β-1，4-木聚糖酶

1．3．1 木聚糖酶概述

1．3．2 木聚糖酶的酶学性质

1．3．3 木聚糖酶的应用

1．3．4 木聚糖酶的研究进展

1．4 α-葡萄糖醛酸酶(α-glucuronidase)

1．4．1 概述

1．4．2 α-葡萄糖醛酸酶的分类

1．4．3 α-葡萄糖醛酸酶的结构及性质

1．4．4 α-葡萄糖醛酸酶酶活测定方法

1．5 本研究的意义及主要内容

1．5．1 本研究的意义

1．5．2 本论文具体研究内容及目标

第二章 东方肉座菌木聚糖酶基因的克隆表达及其酶学性质

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 试剂和仪器

2．1．3 培养基及有关溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 东方肉座菌EU7-22 cDNA的制备

2．2．2 木聚糖酶Ⅲ基因的获得

2．2．3 重组毕赤酵母菌株GS115(pPIC9K-xynⅢ)的构建

2．2．4 重组毕赤酵母GS115(pPIC9K-xynⅢ)的诱导表达

2．2．5 木聚糖酶XYNⅢ的纯化及去糖基化处理

2．2．6 木聚糖酶XYNⅢ的酶学性质研究

2．2．7 XYNⅢ水解低聚木糖及木聚糖的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 东方肉座菌EU7-22总RNA的提取

2．3．2 xynⅢ基因的获得及验证

2．3．3 木聚糖酶Ⅲ cDNA序列分析

2．3．4 毕赤酵母表达载体的构建

2．3．5 毕赤酵母重组转化子的筛选与鉴定

2．3．6 重组毕赤酵母GS115(pPIC9K-xynⅢ)产酶条件优化

2．3．7 木聚糖酶XYNⅢ的纯化及去糖基化处理

2．3．8 XYNⅢ的理化性质研究

2．3．9 木聚糖酶XYNⅢ水解低聚木糖及木聚糖的研究

2．4 本章小结

第三章 黑曲霉α-葡萄糖醛酸酶(gus67)基因的克隆表达

3．1 实验材料

3．1．1 菌种与质粒

3．1．2 试剂和仪器

3．1．3 培养基的制备

3．2 实验方法

3．2．1 α-葡萄糖醛酸酶基因的获得及生物信息学分析

3．2．2 α-葡萄糖醛酸酶毕赤酵母重组菌的构建

3．2．3 GS115(pPIC9K-gus67)的诱导表达

3．2．4 表达产物的活性检测

3．2．5 表达产物的SDS-PAGE分析及蛋白浓度的测定

3．2．6 α-葡萄糖醛酸酶GUS67的纯化及去糖基化研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 α-葡萄糖醛酸酶基因gus67的克隆及生物信息学分析

3．3．2 毕赤酵母表达菌株的构建

3．3．3 重组基因gus67在毕赤酵母中的诱导表达

3．3．4 表达产物GUS67的活性检测

3．3．5 α-葡萄糖醛酸酶GUS67的纯化及去糖基化处理

3．4 本章小结

第四章 半纤维素酶协同降解竹半纤维素的研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验原料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 从竹屑中提取半纤维素

4．2．2 竹半纤维素的理化特性分析

4．2．3 竹半纤维素协同酶解的研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 从竹屑中提取半纤维素

4．3．2 竹半纤维素的理化特性分析

4．3．3 XYNⅢ、GUS67、AnAxh62A协同水解竹半纤维素

4．4 本章小结

第五章 全文总结与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

附录

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢