DEN2感染对MyD88沉默的小鼠树突状细胞表达相关膜分子及炎症因子分泌的影响

摘要

目的：通过 DEN2感染髓样分化因子88（Myeloid Differentiation Factor88，MyD88）沉默的小鼠骨髓来源树突状细胞（Bone Marrow-derived Dendritic Cells，BMDC），分析MyD88在DEN2感染BMDC后对其成熟及相关炎症因子分泌的影响。
　　方法：利用rmIL-4、rmGM-CSF联合诱导培养BMDC，通过细胞染色及流式细胞术鉴定；针对 BMDC MyD88基因，设计并合成3对 MyD88 siRNA，脂质体法转染 BMDC；通过Western blot筛选一对高沉默效率的MyD88 siRNA；常规方法增殖及鉴定DEN2；直接免疫荧光及 RT-PCR鉴定 DEN2吸附 BMDC；流式细胞术分析对照组、感染组、RNAi组、感染 RNAi组、无义 RNAi组 BMDC膜表面分子 CD86、MHC-II的表达，双抗体夹心ELISA法检测上清液中IP-10、TNF-α及IFN-α的分泌水平。
　　结果：
　　1.联合诱导培养至第5d后的BMDC具有典型的DC形态，流式细胞术检测 CD11c、CD86和MHC-II分子的表达百分率分别为70.85±2.66％、28.21±5.21%、44.69±3.88%，为相对未成熟的BMDC。
　　2.与空白对照组相比，序列1、2、3组的MyD88蛋白质表达率分别降低60.8%、78.9%、81.9%；其中序列3的沉默效率最高，具有显著统计学意义（P＜0.01）。
　　3. DEN2可吸附BMDC，与对照组比较，感染组DC膜表面分子CD86表达降低，MHC-II分子增高。与正常对照组比较，DEN2感染RNAi组BMDC的MHC-II分子表达无明显变化，而共刺激分子 CD86表达增高。DEN2感染RNAi组与无义RNAi组比较，无统计学意义（P>0.05）。与RNAi组比较，DEN2感染RNAi组细胞表达CD86及MHC-II无明显变化。
　　4. DEN2感染组与对照组比较，TNF-α、IFN-α及IP-10的水平均增高。与正常组相比，无义RNAi组DC分泌的IP-10及TNF-α的水平增高，且有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，感染RNAi组IP-10、IFN-α无明显变化，而TNF-α分泌增加，且有统计学意义（P＜0.05）。与RNAi组比较，感染RNAi组IP-10及IFN-α水平无变化，TNF-α水平有所增高，但无统计学意义（P=0.76）。
　　结论：
　　1.DEN2可吸附BMDC，并促使其成熟及细胞因子分泌。
　　2.siRNA可沉默 MyD88，有效阻断 DEN2感染 BMDC的胞内信号传导及其所引起的成熟及炎症因子分泌。
　　3.DEN2感染BMDC所致MyD88依赖途径活化，可产生大量的IFN-α。
　　4.MyD88在介导DEN2感染所致BMDC成熟及炎症因子分泌的胞内信号通路中具有重要的作用。

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1. 前言

2 材料和方法

3 结果

4.讨论

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附2 综述 ：MyD88依赖途径与病毒感染的研究进展