干扰素诱导蛋白p204在鼠血管壁细胞的表达及IFI16对人脐动脉平滑肌细胞的生物学功能研究

摘要

目的:研究干扰素诱导蛋白p204在鼠血管壁各成分细胞的基础表达及干扰素(IFN)诱导性。研究p204的人同源蛋白IFI16在人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)的基础表达、IFN诱导性，研究IFI16诱导表达及沉默对HUASMC的生物学影响及可能机制。
　　方法:通过免疫组织化学及免疫印迹(Western blot)观察p204蛋白在成年昆明(KM)小鼠及Wistar或SD大鼠血管壁的表达，通过免疫细胞化学及Western blot观察p204在培养的SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)和血管外膜成纤维细胞(VAF)的表达及分布，通过RT-PCR观察IFNα诱导VSMC上Ifi204 mRNA表达特点。通过Western blot检测IFI16在HUASMC的基础表达及IFN诱导性，分别通过MTT、流式细胞术、免疫细胞化学、Western blot及qRT-PCR检测IFN诱导及IFI16 siRNA沉默时HUASMC增殖、细胞周期及凋亡、NF-κB p65表达及核转位、p21基因表达变化。
　　结果:免疫组织化学染色表明p204抗原在成年KM小鼠心内小静脉及小动脉血管壁内皮细胞(VEC)、内膜、中膜及外膜的细胞中胞浆呈阳性反应，p204在成年Wistar大鼠主动脉内皮、VSMC及外膜均染色阳性，中膜VSMC胞浆染色阳性，弹性纤维膜未着色。Western blot表明p204在SD大鼠主动脉有基础表达，其在VAF的基础表达量明显高于VSMC，免疫细胞化学表明p204在鼠主动脉VSMC细胞同时表达于细胞质及细胞核。应用IFNα1000IU/ml刺激VSMC细胞8小时即诱导Ifi204 mRNA大量表达，IFNα作用24小时时表达更强烈。通过终浓度为1000-2000IU/ml的IFNα干预HUASMC约12-18h，在48-72小时时并不明显抑制细胞增殖，但随着IFNα浓度的增加，其对HUASMC细胞增殖的抑制率亦增加。通过IFNα诱导IFI16大量表达，伴随着p21基因表达上调及NF-κB p65核转位增加，同时S期细胞比例及细胞凋亡明显增加；而通过siRNA下调IFI16的表达则促进了细胞增殖，同时p21基因表达亦减少。
　　结论:p204在小鼠及大鼠血管壁全层和培养的VSMC及VAF均存在基础表达，IFNα可诱导VSMC的Ifi204 mRNA增加。HUASMC存在IFI16的基础表达，亦能被IFNα诱导大量表达，IFNα呈浓度依赖性抑制HUASMC增殖，其抑制VSMC增殖、细胞周期进展及促进凋亡的作用至少部分和诱导IFI16表达、调控p53/p21/CDK通路及NF-κB通路有关。

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中文摘要

前言

第一部分 p204在鼠血管壁细胞的表达研究

1. 材料与方法

1.1 实验一 p204在SD大鼠及KM小鼠血管壁组织及细胞的基础表达

1.2 实验二 RT-PCR检测IFN诱导鼠VSMC细胞Ifi204 mRNA表达

2. 结果

3. 讨论

第二部分 IFN诱导IFI16过表达及IFI16 siRNA沉默对人脐动脉平滑肌细胞的生物学功能的影响及机制

1. 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.2 实验一 IFI16在HUASMC上基础表达及IFN诱导性

1.3 实验二 siRNA转染实验

1.4 实验三 IFI16诱导表达及沉默对HUASMC增殖的影响

1.5 实验四 IFI16诱导表达及沉默对HUASMC细胞周期及凋亡的影响

1.6 实验五 IFI16影响HUASMC生长及凋亡的机制

2. 结果

2.1 HUASMC存在IFI16蛋白基础表达且能被IFNα诱导表达大量增加

2.2 IFNα影响HUASMC增殖与其浓度有关

2.3 IFI16诱导表达及沉默对HUASMC增殖的影响

2.4 IFN通过阻滞细胞周期S期促进HUASMC细胞凋亡

2.5 IFI16通过影响p21表达及p65核转位调控HUASMC生长及凋亡

3. 讨论

参考文献

附彩图

英文摘要

致谢

中英文缩写对照

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综述：p200家族蛋白的研究现状及展望