人低分化胃腺癌甲基化谱的建立与1,25-二羟维生素D3上调高甲基化BMP3基因表达的分子机制及其生物学功能

摘要

胃癌是全球性的恶性疾病的一种，尤其是在发展中国家的我国，发病率相对比较高。在胃腺癌中，低分化胃腺癌具有发病率高，发病年龄小，恶性程度较高，死亡率高的特点。在目前，针对于胃癌的表观遗传学中DNA甲基化的研究较少，且大部分为单个或几个基因甲基化水平的研究，尚未建立相关的人低分化胃癌的甲基化谱，且基于表观遗传学的机理研究较少。
　　因此，为探索低分化胃腺癌相关的表观遗传学机制，本研究首先收集4例临床低分化胃腺癌与胃正常组织样本，两种类型的组织取自同一患者，运用高通量甲基化芯片技术筛选低分化胃腺癌与胃正常组织样本两者差异的甲基化位点，并分析与甲基化调控明显相关的基因。随后与已经报道的低分化胃腺癌相关的表达谱芯片进行比较，找出相关的基因骨形态形成蛋白3(BMP3)。鉴于BMP3与1，25-二羟维生素D3在成骨和骨分化中的作用和之前的研究基础，研究1，25-二羟维生素D3对参与BMP3基因的影响，继而在分子水平探索其与胃癌相关的分子机制和生物学功能。
　　本研究主要结果如下:
　　1、建立人低分化胃腺癌甲基化谱，表明低分化胃腺癌的发生和发展与基因组的甲基化状态关系相关密切;
　　2、甲基化芯片筛选以及与研究报道的整合发现有95个相对应的受甲基化调控的基因，其中BMP3差异明显;
　　3、BMP3具有7个高甲基化位点且其蛋白质表达受甲基化水平的影响;
　　4、过表达BMP3基因后，可以促进低分化胃癌细胞系SGC-7901的凋亡;
　　5、BMP3在正常人胃黏膜细胞系GES-1中高表达，而在人低分化胃癌细胞系BGC-823，SGC-7901细胞系中表达显著较低;
　　6、1，25-二羟维生素D3上调BMP3的转录水平和翻译水平，并且对SGC-7901和BGC-823胃癌细胞系起到增殖抑制的作用，其主要对SGC-7901细胞周期的S期产生影响;
　　7、VDR与BMP3启动子区域的VDRE序列结合可能上调BMP3基因的表达。
　　综上所述，本研究报道了低分化胃腺癌相关的差异甲基化位点及其相关的基因，并对与胃癌关系密切的BMP3基因以及1，25-二羟维生素D3对其调控机理进行了相应的研究，期望以此来对低分化胃癌的发病机理和治疗有所助力。

目录

声明

摘要

缩略词及英文缩写一览表

1 前言

1．1 DNA甲基化

1．1．1 简介

1．1．2 DNA甲基化对基因表达的调控

1．1．3 DNA甲基化与肿瘤

1．2 骨形态发生蛋白3

1．2．1 简介

1．2．2 结构

1．2．3 功能

1．3 维生素D3

1．3．1 简介

1．3．2 结构

1．3．3 维生囊D3与骨质疏松

1．3．4 维生素D3与癌症

1．4 立项背景

2 材料与方法

2．1 主要试剂药品和仪器设备

2．1．1 主要试剂药品

2．1．2 主要仪器设备

2．2 样本收集病理确认

2．2．1 病人信息收集

2．2．2 石蜡包埋

2．2．3 HE染色

2．2．4 病理判断

2．3 乳腺癌、胃癌、结肠癌血浆内25-羟维生素D3的检测

2．4 高通量芯片技术

2．4．1 样本DNA提取

2．4．2 DNA甲基化芯片

2．4．3 芯片数据分析

2．5 分子生物学技术

2．5．1 DNA相关的实验方法

2．5．2 细胞相关的实验方法

2．5．3 RNA相关的实验方法

2．5．4 蛋白质相关的实验方法

3 结果和讨论

3．1 结果

3．1．1 人低分化胃腺癌甲基化谱的建立

3．1．2 甲基化芯片数据与已报道表达谱芯片数据的整合分析

3．1．3 BMP3在人胃黏膜细胞系GES-1高表达而在低分化胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901中低表达

3．1．4 BMP3的蛋白质表达受基因的甲基化调控

3．1．5 BMP3过表达抑制人低分化胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901的增殖促进凋亡

3．1．6 25-羟维生素D3在乳腺癌、结肠癌和胃腺癌病人血清中含量的检测与分析

3．1．7 1，25-二羟维生素D3抑制人低分化胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901的增殖

3．1．8 1，25-二羟维生素D3上调人低分化胃癌细胞系SGC-7901中BMP3的蛋白质表达

3．1．9 VDR与BMP3启动子区域的VDRE序列结合

3．2 讨论

3．2．1 人低分化胃腺癌的发生与DNA甲基化密切相关

3．2．2 BNP3的表达调控受到启动子区域的甲基化的调控

3．2．3 25-羟维生素D3在胃癌病人的外周血中含量较低且其与胃癌的关系密切

3．2．4 BMP3与维生素D3不但在骨分化过程中发挥作用在胃癌中维生素D3可以上调BMP3的蛋白质水平发挥抑制增殖和促进凋亡的作用

3．2．5 1，25-二羟维生素D3通过与VDR与RXR形成反应元件来增强BMP3的蛋白质的表达

4 结论

5 展望

致谢

7 附录

参考文献

9 图表索引

10 在学期间主要成果