菊花心江蓠无性系构建及其不定芽诱导和固碳机制的研究

摘要

大型海藻组织培养(seaweed tissue culture，STC)技术可以解决大型海藻栽培中的诸多问题，主要包括高品质藻种的保存、大规模育苗生产以及基因工程研究等。然而，STC还面临着很多困难，例如:愈伤组织(callus)诱导与再分化困难、且形成率低;对于很多藻种，切块培养后会快速极性再生不定芽(adventitious branches，ABs)而非callus;同时，这一过程会因藻种的不同而对外源植物激素的敏感性有所不同。研究表明，转录因子、MicroRNA（miRNA）和内源植物激素等因素在细胞脱分化与再分化、植物极性建成以及抗逆机制等生物过程中扮演着重要角色。而正是由于STC缺乏这方面的分子知识，才使得STC技术落后，并不像高等植物那样成熟而广泛地应用到实际生产中。此外，菊花心江蓠可以快速吸收海水中的氮和磷，且耐高温，因此它可以作为热带海域防治海水富营养化以及缓解海水变暖和海水酸化的优良藻种。然而，由于我国大陆菊花心江蓠引自我国台湾，种质保存和种苗来源面临一定困难，因此本文对该江蓠无性系构建方法进行了探讨;同时，由于菊花心江蓠组织培养表现为再生ABs，所以我们还以该江蓠为例对STC过程中ABs的发生机制进行了研究，我们首次利用高通量测序技术对菊花心江蓠ABs形成以及被抑制过程中mRNA和miRNA表达水平的变化进行了测定。由于ABs只在外植体生物学顶端形成，而且生长素极性运输(PAT)和钙离子(Ca2+)等信号分子/离子在植物极性建成方面起着不可替代的作用，所以我们还利用非损伤微测技术(NMT)对ABs形成以及被抑制期间藻体内的这些信号分子/离子进行了实时动态检测。此外，本文还对菊花心江蓠的固碳能力和固碳机制进行了初步研究。具体结果如下:
　　1.通过转录组测序技术成功拼接组装获得14070个转录本(unigene)。通过差异表达分析我们成功的筛选出调控ABs形成的重要代谢通路，主要包括植物激素信号传导途径(plant hormone signal transduction)、ABCB1家族基因、磷脂酰肌醇(PI)信号传导途径、抗氧化系统等。另外，还成功的检测到3287个简单重复序列(SSR);同时，我们分别从野生藻体(CK)、诱导出不定芽藻体(EWAB)和未诱导出不定芽藻体(NPA)转录本中检测出12552、4198以及5145条单核苷酸多态性(SNP)，这为以后研究江蓠属海藻基因突变和基因标记（marker）筛选提供了一定理论参考。通过转录组测序并没有注释到完整的经典的生长素(auxin)等其他植物激素信号传导途径，这可能是造成STC过程中外植体对外源激素不敏感的原因;同时，我们还发现菊花心江蓠ABs的直接形成是一个非常复杂的生理过程，受多种因素的共同调控，例如生长素(auxin)和乙烯(ET)之间存在协同作用;而auxin和脱落酸(ABA)或者油菜素内酯(BRs)之间存在拮抗作用;此外，ABA、水杨酸(SA)和抗氧化系统之间也存在着协同作用。更多的结论还需进一步实验验证。
　　2.通过RNA-seq技术首次成功地构建了菊花心江蓠小RNA文库，并对其中的miRNA进行了靶基因预测及其功能注释。在CK、EWAB、NPA样品中分别筛选到了133、149、139个miRNAs，这极大的丰富了江蓠中已知miRNA的数量，并成功的预测到了30个新的miRNAs，这为以后深入研究大型海藻无性系发育机制、有效解决大型海藻种质保存和种苗培育等难题提供了一定理论基础。我们还分析了miRNA在不同样品间的表达模式并对差异表达的miRNA进行了靶基因预测及其功能富集。这些差异表达miRNA的靶基因涉及多个生物过程，主要包括auxin、ABA等植物激素信号传导途径、ABC转运子、抗氧化系统以及磷脂酶D等，说明miRNA在菊花心江蓠ABs的再生过程中起着非常重要的调控作用。
　　3.利用NMT技术首次成功地直接测定了菊花心江蓠体内IAA、Ca2+和H2O2流速的实时动态变化。研究发现，生长素PAT确实存在于大型海藻体内，且PAT抑制剂NPA可能是通过结合ABCB1转运子来抑制生长素的外流，进而抑制ABs的极性再生;菊花心江蓠藻体在切块培养后，外植体生物学基部会向顶端持续输送IAA以保证ABs形成对IAA的正常需求。如果这一运输过程被NPA阻止，那么ABs也不会被诱导出;同时，外植体内IAA含量在NPA处理后会急剧增加，因此，IAA的过度积累也会超过ABs形成对IAA的正常需求反而抑制其再生;我们还发现Ca2+和H2O2信号离子/分子调控了菊花心江蓠ABs的再生过程，而且它们和PAT以及auxin信号传导之间存在着复杂的网络调控关系。本文研究为澄清STC过程中ABs的发生机制提供了新的视野和帮助。
　　4.利用总有机碳(TOC)分析技术测定了菊花心江蓠的光合固碳能力和固碳机制。研究发现，菊花心江蓠光合固碳的最适温度为30℃，而且该江蓠在35℃高温条件下固碳效率仍维持在较高水平，具有耐高温的特点，为不同海域不同气候条件下海藻养殖种类的选择提供了科学依据，同时也为应对海水温度逐年升高、有效利用大型海藻进行固碳、储碳进而缓解海水变暖加剧现象提供了可靠的藻种选择;菊花心江蓠存在两种利用HCO3-的方式，分别为1）胞外碳酸酐酶调节途径间接吸收HCO3-;2）通过细胞膜上的阴离子载体蛋白直接吸收HCO3-;通过转录组测序以及对PEPc mRNA在不同条件下表达水平的测定，我们推测PEPc型类C4途径可能存在于菊花心江蓠藻体内，这对于研究江蓠等大型海藻固碳机制以及准确有效的评估大型海藻的固碳和储碳能力提供了有效的科学依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 大型海藻无性繁殖系

1．2 大型海藻组织培养研究现状

1．2．1 callus形成率低

1．2．2 不能控制callus的生长与分化

1．2．3 不定芽(ABs)更容易诱导

1．3 海藻无性系发育机制的研究

1．3．1 内源激素

1．3．1 miRNA

1．4 高通量测序概述

1．4．1 第二代高通量测序技术简介

1．4．2 转录组测序

1．4．3 小RNA测序

1．5 非损伤微测技术

1．6 菊花心江蓠简介

1．7 本研究的目的和内容

1．7．1 研究目的

1．7．2 研究内容

第二章 菊花心江蓠不定芽(ABs)诱导的影响因素及其无性系构建的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 藻体采集与处理

2．1．2 菊花心江蓠的切块培养

2．1．3 ABs离体培养

2．2 结果与分析

2．2．1 菊花心江蓠无性系构建

2．2．2 温度对菊花心江蓠ABs诱导的影响

2．2．3 外源植物激素对ABs诱导的影响

2．2．4 低温条件下(20℃)不同光质对ABs诱导的影响

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 菊花心江蓠ABs形成以及被抑制时的转录组测序分析

3．1 材料与方法

3．1．1 藻体采集与处理

3．1．2 菊花心江蓠RNA提取与质量分析

3．1．3 cDNA文库构建和测序

3．1．4 转录组数据处理与分析

3．1．5 SSR分析

3．1．6 SNP的查找和分析

3．1．7 差异表达基因qRT-PCR验证

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA质量分析

3．2．2 测序数据组装与分析

3．2．3 转录组数据功能注释

3．3 讨论

3．3．1 生长素(auxin)极性运输和信号传导途径

3．3．2 细胞分裂素(CTK)合成途径

3．3．3 脱落酸(ABA)信号传导途径

3．3．4 乙烯(ET)信号传导途径

3．3．5 油菜素内酯(BRs)合成途径

3．3．6 水杨酸(SA)信号传导途径

3．3．7 抗氧化系统

3．3．8 磷脂酰肌醇信号传导途径

3．4 小结

第四章 菊花心江蓠ABs形成以及被抑制时的小RNA测序分析

4．1 材料与方法

4．1．1 藻体采集与组织培养

4．1．2 总RNA提取与质量分析

4．1．3 小RNA分离、文库构建及测序

4．1．4 测序数据处理

4．1．5 差异表达miRNA定量验证

4．2 结果与分析

4．2．1 菊花心江蓠内源小RNA分析

4．2．2 菊花心江蓠新miRNA预测

4．2．3 miRNA差异表达分析

4．2．4 菊花心江蓠已知miRNA和新miRNA的靶基因预测及功能注释

4．2．5 miRNA与mRNA关联分析

4．2．6 菊花心江蓠差异表达miRNA的qRT-PCR验证

4．3 讨论

4．3．1 生长素(auxin)信号传导途径

4．3．2 细胞分裂素(CTK)信号传导途径

4．3．3 脱落酸(ABA)信号传导途径

4．3．4 磷脂酶D(PLD)

4．3．5 其他信号传导途径

4．4 小结

第五章 菊花心江蓠ABs形成以及被抑制时IAA流速变化分析

5．1 材料与方法

5．1．1 藻体采集与组织培养

5．1．2 IAA、Ca2+、H2O2流速和流向测定

5．2 结果分析

5．2．1 IAA流速分析

5．2．2 Ca2+流速分析

5．2．3 H2O2流速分析

5．2．4 IAA含量分析

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 菊花心江蓠固碳机制的初步研究

6．1 材料与方法

6．1．1 实验仪器与试剂

6．1．2 温度对菊花心江蓠固碳能力的影响

6．1．3 光照对菊花心江蓠固碳能力的影响

6．1．4 不同抑制剂对菊花心江蓠固碳能力的影响

6．2 结果与分析

6．2．1 温度对菊花心江蓠等大型海藻提升海水pH速率的影响

6．2．2 温度对菊花心江蓠等大型海藻吸收海水中DIC及PGR的影响

6．2．3 温度对菊花心江蓠等大型海藻释放DOC的影响

6．2．4 光照对菊花心江蓠等大型海藻固碳效率的影响

6．2．5 不同抑制剂对菊花心江蓠固碳能力的影响

6．3 讨论

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 全文结论

7．2 本文创新点

7．3 展望

参考文献

博士期间发表、待发表论文

致谢