人脐带间充质干细胞角膜缘注射后的命运及其对局部微环境的影响

摘要

目的:近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)结膜下注射被用来治疗眼表化学伤，在动物实验中表现了良好的效果。但结膜下注射后MSC的命运及其对局部微环境的影响还不清楚。我们通过在大鼠角膜缘注射人脐带间充质干细胞来探究MSC在角膜缘球结膜下的存活、迁移、增殖、分化及对角膜缘微环境的影响，同时观察MSC对眼表上皮增殖及分化的影响，以及对角膜缘干细胞损伤的修复作用。
　　方法:采用改良的胶原酶及透明质酸酶联合消化法分离培养获得人脐带间充质干细胞，并进行流式细胞学鉴定。SD大鼠右眼颞侧角膜缘球结膜下注射2×105个MSC的DMEM混悬液，左眼相同部位注射同样体积的DMEM培养基作为对照组。注射后第3、6、9及12天，进行裂隙灯照相观察眼表，然后处死实验动物，进行HE染色、双重免疫荧光染色(Vimentin、Ki67、α-SMA)、TUNEL染色、流式细胞学检测(CD45、CD11b)、Real-Time PCR（生长因子、炎症因子、胶原及信号通路相关分子）、ELISA检测(SCF、HGF、IL-1β、IL-10)及蛋白印迹检测(VEGF、Ⅲ型胶原、Notch1)。为了探究不同免疫状态对MSC命运及对周围组织的影响，选取经4GyX线照射大鼠及裸大鼠进行MSC角膜缘注射，注射方法及细胞量同前，注射后第3、6、9及12天，进行裂隙灯照相观察结膜充血水肿情况，然后处死实验动物并进行以上检测。为验证MSC对损伤的修复作用，选取雄性健康SD大鼠建立角膜缘损伤模型，然后于角膜缘球结膜下注射50μl含2×105个MSC的DMEM混悬液，左眼注射同样体积的DMEM培养基做为对照组。注射后6天内每天观察角膜上皮修复情况、新生血管形成及结膜充血情况。
　　结果:采用改良的酶消化法对脐带进行分离培养可得到形态良好、增殖能力强的MSC，流式细胞学鉴定符合现有标准。MSC注射后第6天角膜缘球结膜可见轻度充血;HE染色显示结膜下细胞团逐渐缩小，伴有少量炎症细胞浸润，注射区域角膜缘结膜上皮轻度增厚，以注射后第6天较为明显;人Vimentin免疫荧光染色显示MSC注射后阳性细胞逐渐减少，第9天完全消失，且并未转移到其他部位，Vimentin阳性细胞中α-SMA表达阴性且仅见少量Ki67阳性细胞，但其周围结膜基质及角膜缘上皮基底层可见多量Ki67阳性表达，角膜缘上皮基底层细胞K14染色增强，均以第3天及第6天较明显;TUNEL与Vimentin双重染色可见，Vimentin阳性细胞中可见多量TUNEL阳性细胞，随着观察时间的延长逐渐减少;流式细胞学检测结膜中CD45及CD11b比例轻度升高，第9天达到高峰，而后逐渐降低至正常;Real-Time PCR结果显示促炎因子及抑炎因子的表达均有升高，且幅度相当，多种生长因子及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原均在第3天及第6天明显升高;ELISA及蛋白印迹结果与PCR基本一致。MSC注射到X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下，未引起明显炎症反应，Vimentin与Ki67染色结果显示，MSC在X线照射大鼠角膜缘结膜下可存活9天，在裸大鼠中可存活12天，Vimentin阳性细胞的Ki67表达阴性，但Vimentin阳性细胞周围结膜中仍可见多量Ki67阳性细胞，Real-Time PCR显示X线照射大鼠结膜中的炎症因子轻度升高，而裸大鼠的持续正常水平，但两者结膜中多种生长因子及胶原的表达均明显增加。将MSC角膜缘球结膜下注射于角膜缘损伤大鼠，第2天即可观察到MSC组角膜上皮缺损面积明显较对照组小，角膜缘处可见长度约1～2mm新生血管侵入角膜，到第4天所有大鼠的角膜上皮恢复完整，MSC组新生血管已全部消退，整个过程中大鼠球结膜并未出现明显充血。
　　结论:MSC角膜缘球结膜下注射后能存活约9～12天，并未发生增殖、转移及分化为肌成纤维细胞。MSC可通过旁分泌作用、轻度炎症刺激及Notch与BMP信号通路的激活影响角膜缘微环境，从而促进角膜缘干细胞的增殖及角膜上皮的修复。

目录

声明

摘要

未标题

第一章 前言

1．1 间充质干细胞概述

1．1．1 MSC的概念及来源

1．1．2 MSC的分化潜能

1．1．3 MSC的免疫特性

1．1．4 MSC的原代培养

1．1．5 MSC的鉴定

1．1．6 MSC的标记

1．2 间充质干细胞用于角膜重建的研究进展

1．2．1 MSC在眼科治疗的应用方法

1．2．2 MSC的转分化作用

1．2．3 MSC的抗炎作用

1．2．4 MSC调节新生血管的作用

1．2．5 MSC在角膜修复中的作用

1．2．6 MSC与器官移植

1．3．角膜缘微环境(niche)

1．4 角膜缘微环境相关疾病

1．5 角膜上皮干细胞微环境的体内重建与体外模拟

1．5．1 角膜上皮干细胞微环境的体内重建

1．5．2 角膜上皮干细胞微环境的体外模拟

1．6 间充质干细胞对角膜缘干细胞或角膜缘微环境的影响

1．7 研究意义

1．8 技术路线

1．8．1 MSC的分离培养与鉴定

1．8．2 MSC在大鼠角膜缘球结膜下注射后的命运及对角膜缘微环境的影响

1．8．3 角膜缘球结膜下注射MSC促进上皮修复及新生血管形成

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 脐带

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要化学试剂与耗材

2．1．4 主要抗体

2．1．5 主要仪器

2．1．6 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 人脐带间充质干细胞(MSC)原代及传代培养

2．2．2 流式细胞仪鉴定间充质干细胞

2．2．3 正常SD大鼠球结膜下注射间充质干细胞

2．2．4 角膜缘损伤大鼠球结膜下注射间充质干细胞

2．2．5 大鼠眼球冰冻切片的制备

2．2．6 HE染色

2．2．7．免疫荧光染色(双重染色)

2．2．8 细胞凋亡染色(TUNEL染色+Vimentin双重染色)

2．2．9 注射后大鼠结膜组织炎症细胞流式细胞检测

2．2．10 结膜组织mRNA的提取与逆转录

2．2．11 实时定量PCR(Real-Time PCR)

2．2．12 蛋白印迹实验

2．2．13 ELISA

第三章 实验结果

3．1 人脐带问充质干细胞(MSC)的原代培养与流式鉴定

3．1．1 原代培养MSC形态观察

3．1．2 原代培养HUMSC的流式鉴定

3．2 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后的命运

3．2．1 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后的局部表现

3．2．2 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后的增殖情况

3．2．3 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射的存活及迁移

3．2．4 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后的分化情况

3．3 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后对周围组织及角膜缘微环境的影响

3．3．1 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后对结膜上皮的影响

3．3．2 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后对角膜缘的影响

3．3．3 MSC到正常大鼠角膜缘球结膜下注射后引起局部组织细胞增殖

3．3．4 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后引起炎症细胞的浸润及炎症因子的表达改变

3．3．5 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后的旁分泌作用及刺激局部结膜组织生长因子表达的改变

3．3．6 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后刺激结膜组织胶原表达改变

3．3．7 MSC在正常大鼠角膜缘球结膜下注射后刺激结膜组织Notch及BMP信号通路激活

3．4 不同免疫状态下的大鼠对角膜缘球结膜下注射的MSC的反应

3．4．1 MSC在X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下注射后的局部表现及HE染色

3．4．2 MSC在X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下注射后对周围组织的影响

3．4．3 MSC在X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下注射后引起的局部炎症反应

3．4．4 MSC在X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下注射后刺激局部结膜组织生长因子表达的改变

3．4．5 MSC在X线照射大鼠及裸大鼠角膜缘球结膜下注射后刺激局部结膜组织胶原表达的改变

3．5 角膜缘球结膜下注射MSC促进大鼠角膜缘损伤模型的上皮修复及新生血管形成

第四章 讨论

4．1 MSC来源的选取

4．2 MSC分离培养的方法及鉴定的选择

4．3 实验动物及动物模型的选取

4．4 MSC角膜缘球结膜下注射后的命运

4．4．1 MSC角膜缘球结膜下注射后的存活

4．4．2 MSC角膜缘球结膜下注射后的迁移

4．4．3 MSC角膜缘球结膜下注射后的增殖

4．4．4 MSC角膜缘球结膜下注射后的分化

4．5 MSC角膜缘球结膜下注射后对角膜缘微环境的影响

4．5．1 MSC角膜缘球结膜下注射后引起的炎症反应

4．5．2 MSC角膜缘球结膜下注射后的旁分泌作用及对周围组织的影响

4．5．3 MSC角膜缘结膜下注射后引起结膜Notch及BMP信号通路的改变

4．6 MSC角膜缘球结膜下注射促进角膜上皮修复及新生血管形成

第五章 全文总结

参考文献

致谢

科研成果