大黄鱼干细胞诱导相关多能性因子的克隆与表达分析

摘要

通过iPSCs技术获得iPSCs，建立个体特异的多能干细胞系，可为生长发育、种质资源保护、疾病防治及药物筛选研究等提供宝贵的实验材料，是一条新的从根本上解决大黄鱼养殖中的各种难题的有效策略模式。其中，多能性因子对iPSCs技术的研究是必不可少的，它们在调控胚胎干细胞(ESCs)的自我更新和多能性、原始生殖细胞(PGCs)的形成、早期胚胎发育、生殖细胞发生、器官发生、再生及增殖、生长、分化、凋亡等细胞过程等方面发挥重要作用。然而关于大黄鱼多能性因子的研究尚属空白。本文采用SMART-RACE技术克隆了大黄鱼Oct4、Sox2、Klf4和cMyc四个多能性基因，并进行了生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和原位杂交技术研究了大黄鱼四个多能性基因的时空表达模式;还对组织细胞培养和基因转染进行了初步研究。主要研究成果如下:
　　1.克隆获得了大黄鱼Oct4、Sox2、Klf4和cMyc4个多能性基因。Lc-Oct4基因cDNA全长2642bp，5'端非编码区(5' UTR)长623bp，3'UTR长567bp，开放阅读框(ORF)编码一个476个氨基酸(aa)的蛋白，Lc-Oct4蛋白的N-端和C-端各有一个保守的DNA结合区—POUs区和HOX区;系统进化分析表明，大黄鱼Lc-Oct4蛋白序列与硬骨鱼的一致性高(65-85％)，与四足动物的一致性低(38-65％)，在进化树上大黄鱼Lc-Oct4蛋白最先与半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）聚支。Lc-Sox2基因cDNA全长2135bp，5'UTR长498bp，3' UTR长646bp，ORF编码一个322aa的蛋白，Lc-Sox2蛋白具有一个高度保守的DNA结合区—HMG盒;系统进化分析表明，Lc-Sox2蛋白序列在脊椎动物中的一致性都很高(77-98％)，进化树上Lc-Sox2蛋白最先与红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）聚支。Lc-Klf4基因cDNA全长2404bp，5'UTR长255bp，3'UTR长790bp，ORF编码一个452aa的蛋白，Lc-Klf4蛋白具有三个高度保守的DNA结合区—C2H2锌指结构;系统进化分析表明，Lc-Klf4蛋白序列与硬骨鱼的一致性高(66-93％)，与四足动物的一致性低(＜48％)，进化树上Lc-Klf4蛋白最先与深裂眶锯雀鲷（Stegastes partitu）聚支。Lc-cMy基因cDNA全长2089bp，5'UTR长338bp，3'UTR长408bp，ORF编码一个440aa的蛋白，Lc-cMyc蛋白具有一个特征性的高度保守的HLH-LZ作为DNA结合区;系统进化分析表明，Lc-cMyc蛋白序列与硬骨鱼的一致性高(71-91％)，与四足动物的一致性低(54-60％)，进化树上Lc-cMyc蛋白最先与舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）和革首南极鱼（Nototheniacoriiceps）聚支。
　　2.组织表达:qRT-PCR分析显示，Lc-Oct4基因在大黄鱼卵巢中呈现超高量的表达，并在635dph卵巢中的表达量最高;原位杂交结果也表明，Lc-Oct4基因主要分布于不同发育阶段卵母细胞的细胞质中，并在第Ⅱ期晚期和第Ⅲ期卵母细胞中的表达水平最高;Lc-Oct4基因在精原细胞和初级精母细胞中也有一定量的表达。Lc-Sox2基因主要高表达于脑、鳃、胃、性腺中，且在脑和眼中的表达具有性别差异，雌性高于雄性。Lc-Klf4基因在组织中广泛表达且具有性别差异，在雌鱼中的表达水平依次为脑＞鳃＞眼＞心，在雄鱼中为心＞精巢＞鳃＞脑，其中，在心、鳃、精巢中的表达为雄鱼＞雌鱼，在眼中则为雌鱼＞雄鱼;Lc-Klf4基因在精巢中的表达以635dph中的水平最高，且主要分布于精母细胞中。Lc-cMyc基因表达的性别差异仅存在于性腺中，Lc-cMyc基因特异性地极高量表达于卵巢中，且在635dph卵巢中的表达水平最高，主要分布于第Ⅱ期晚期和第Ⅲ期早期卵母细胞的细胞质中;在头肾和精巢中也有一定量的表达。
　　3.胚胎表达:qRT-PCR分析表明，Lc-Oct4基因在胚胎发育过程中的表达水平依次为多细胞期＞囊胚期=原肠胚期;整胚原位杂交(WISH)结果也显示，Lc-Oct4基因仅在从2-细胞期至早期原肠胚的早期胚胎发育阶段表达，且在16-细胞期达到峰值。Lc-Sox2基因属于合子型的表达模式，从囊胚期开始呈动态的表达，其中在原肠胚期和胚孔封闭期的表达量水平高，在孵出后1天的仔鱼中Lc-Sox2基因主要表达于胚胎的头部和PGCs区。Lc-Klf4基因呈现合子型的表达模式，从原肠胚晚期开始表达，在胚孔封闭期、眼泡出现期和晶体出现期中的表达水平高;WISH结果也显示，Lc-Klf4基因主要分布于晚期胚胎的背部和头部。Lc-cMyc基因在各胚胎期中均有不同程度的表达，在早期胚胎发生中（2-细胞期—多细胞期），Lc-cMyc基因的表达水平非常高，在2-细胞期达到峰值;在胚胎发生晚期（囊胚期—孵出后1天的仔鱼），Lc-cMyc基因的表达水平依次为孵出后1天的仔鱼＞孵出前期＞眼泡出现期=多细胞期＞心跳期，随着胚胎的发育，Lc-cMyc基因逐渐向胚胎背部聚集，最后主要分布于胚胎头部。
　　4.采用Lipofectamine2000脂质体将pAc5.1B-EGFP质粒成功转染到大黄鱼肝脏和脾脏的原代细胞中，转染率达到25-30％。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 诱导性多能干细胞(iPSCs)技术的研究进展

1．1．1 经典DNA法

1．1．2 蛋白质法

1．1．3 小分子化合物法

1．1．4 仙台病毒法

1．1．5 RNAs法

1．2 多能性因子的研究进展

1．2．1 Oct4

1．2．2 Sox2

1．2．3 Klf4

1．2．4 cMyc

1．3 本研究的目的和意义

1．3．1 目的意义

1．3．2 技术路线

参考文献

第二章 大黄鱼多能性因子的克隆与分析

2．1 材料

2．1．1 实验鱼

2．1．2 药品试剂

2．1．3 实验仪器设备

2．1．4 溶液配制

2．1．5 引物

2．2 方法

2．2．1 总RNA的提取

2．2．2 RNA逆转录为cDNA第一链

2．2．3 扩增目的基因全长cDNA

2．2．4 PCR产物的回收及纯化

2．2．5 目的片段与载体连接

2．2．6 感受态细胞的转化及筛选

2．2．7 阳性克隆的检测

2．2．8 质粒测序

2．2．9 目的基因cDNA全序列的获得

2．2．10 目的基因的生物信息学分析

2．3 结果

2．3．1 Lc-Oct4基因cDNA全长序列、氨基酸序列及系统进化分析

2．3．2 Lc-Sox2基因cDNA全长序列、氨基酸序列及系统进化分析

2．3．3 Lc-Klf4基因cDNA全长序列、氨基酸序列及系统进化分析

2．3．4 Lc-cMyc基因cDNA全长序列、氨基酸序列及系统进化分析

2．4 讨论

2．4．1 Lc-Oct4基因

2．4．2 Lc-Sox2基因

2．4．3 Lc-KLf4基因

2．4．4 Lc-cMyc基因

参考文献

第三章 大黄鱼多能性因子的时空表达

3．1 材料

3．1．1 实验鱼

3．1．2 药品试剂

3．1．3 实验仪器设备

3．1．4 溶液配制

3．1．5 引物

3．2 方法

3．2．1 荧光定量PCR(qRT-PCR)

3．2．2 原位杂交

3．3 结果

3．3．1 大黄鱼Lc-Oct4基因的时空表达模式

3．3．2 大黄鱼Lc-Sox2基因的时空表达模式

3．3．3 大黄鱼Lc-Klf4基因的时空表达模式

3．3．4 大黄鱼Lc-cMyc基因的时空表达模式

3．3．5 大黄鱼各多能性因子的表达谱比较

3．4 讨论

3．4．1 Lc-Oct4基因

3．4．2 Lc-Sox2基因

3．4．3 Lc-Klf4基因

3．4．4 Lc-cMyc基因

3．4．5 大黄鱼各多能性因子的表达谱比较

参考文献

第四章 大黄鱼多能性干细胞诱导初探

4．1 材料

4．1．1 实验鱼

4．1．2 药品试剂

4．1．3 实验仪器设备

4．1．4 溶液配制

4．2 方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 基因转染

4．3 结果

4．3．1 大黄鱼肝脏和脾脏细胞的原代培养及传代培养

4．3．2 EGFP基因的表达

4．4 讨论

4．4．1 大黄鱼原代细胞培养及传代培养

4．4．2 大黄鱼基因转染

参考文献

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

致谢

在学期间参加的科研项目及成果