丙戊酸钠对阿霉素体外抗乳腺癌作用的影响及其与缝隙连接通讯之间的关系

摘要

目的：⑴观察丙戊酸钠（Valproate acid sodium, VPA）对乳腺癌Hs578T细胞缝隙连接功能（gap junction, GJ）的影响及其对阿霉素（Adriamycin, ADM）体外抗肿瘤作用的影响。⑵探讨丙戊酸钠改变GJ功能的可能机制。
　　方法：①MTT法检测VPA对Hs578T细胞的细胞毒性。②细胞接种荧光示踪法检测VPA对Hs578T细胞GJ功能的影响。③MTT法检测ADM对Hs578T细胞的细胞毒性。④用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞（细胞之间有紧密接触，有条件形成GJ）与生长未融合细胞（细胞之间无接触，无条件形成GJ），在上述不同密度接种的细胞，采用MTT法观察5mM VPA对ADM的细胞毒性的影响。为了进一步验证在有GJ形成的条件下，VPA对ADM细胞毒性的影响，我们采用MTT法检测不同浓度的VPA（0、2.5、5、10 mM）作用Hs578T细胞24 h后，对ADM的细胞毒性的影响和5 mM VPA作用Hs578T细胞不同时间（0、6、12、24 h)，对ADM的细胞毒性的影响。⑤用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞（细胞之间有紧密接触，有条件形成GJ）与生长未融合细胞（细胞之间无接触，无条件形成GJ），在上述不同密度接种的细胞，采用Annexin V/PI双染法观察5 mM VPA对ADM诱导细胞早期凋亡作用的影响。实验观察5 mM V PA预处理Hs578T细胞24 h，再用1μM ADM处理Hs578T细胞8 h，ADM诱导的细胞早期凋亡率的变化。⑥在有GJ形成的条件下采用Hochest33258荧光染色法检测5 mM VPA处理Hs578T细胞24 h，对ADM诱导细胞晚期凋亡作用的影响。⑦Western Blotting检测不同浓度的VPA（0、1.25、2.5、5 mM）处理Hs578T细胞24 h，对细胞Cx43总蛋白表达的影响。此外，在此实验中进一步采用 Western Blotting观察5 mM VPA处理Hs578T细胞不同时间（0、6、12、24 h）后，对细胞Cx43总蛋白表达的影响。⑧细胞免疫荧光法检测不同浓度的VPA（0、0.625、1.25、2.5、5 mM）处理Hs578T细胞24 h，对细胞表面Cx43蛋白表达的影响。此外，在此实验中进一步采用细胞免疫荧光法检测5 mM VPA处理Hs578T细胞不同时间（0、6、12、24 h）后，对细胞表面Cx43蛋白表达的影响。⑨Western Blotting检测不同浓度的VPA（0、0.625、1.25、2.5、5、10 mM）处理Hs578T细胞24 h，对细胞Src激酶表达的影响。此外，在此实验中进一步采用 Western Blotting检测5 mM VPA处理Hs578T细胞不同时间（0、6、12、24 h）后，对细胞Src激酶表达的影响。⑩荧光接种示踪法检测不同浓度的PP2（0、1、2、4、8μM）处理Hs578T细胞24 h，对细胞GJ功能的影响。此外，在此实验中进一步采用荧光接种示踪法检测8μM PP2处理Hs578T不同时间（0、6、12、24 h），对细胞GJ功能的影响。
　　结果：⑴MTT检测结果显示VPA在0～10 mmol/L的浓度范围内并不影响细胞存活率。细胞接种荧光示踪结果显示VPA（1.25～5 mmol/L）处理Hs578T细胞24 h，可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递（P<0.01）。与对照组相比，VPA处理后细胞的荧光传递功能分别增加了40.12％、110.23%、140.13%和160.34%；5 mmol/L丙戊酸钠处理Hs578T细胞不同时间（6 h、12 h和24 h）可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递（P<0.01）。与对照组相比，VPA预处理不同时间后细胞的荧光传递功能分别增加了70.06%、110.26%和160.31%。结果表明，在Hs578T细胞中VPA可以显著增强GJ功能。推测，在Hs578T细胞中VPA可以增强ADM的体外抗肿瘤作用。⑵MTT检测结果显示ADM（0.5、1、2、4、8μmol/L）作用Hs578T细胞24 h，细胞存活率分别为91.12%、79.15%、70.01%、50.07%和46.23%。MTT法检测结果显示在高密度接种（有GJ形成）条件下，用5 mM VPA增强GJ功能后，8μM ADM处理Hs578T细胞24 h，细胞存活率显著低于8μM ADM单用组（P<0.01）；而在低密度接种（无GJ形成）条件下，用5 mM VPA预处理组的细胞存活率与8μM ADM单用组相比无显著差别（P>0.05）。同时 MTT检测结果显示在细胞融合的条件下，VPA（2.5、5、10 mM）预处理Hs578T细胞24 h，1μM ADM作用细胞24 h后的细胞存活率都显著高于ADM单用组（P<0.01）。并且 MTT检测结果显示在细胞融合的条件，随着5 mM V PA预处理时间的延长，可以显著增强ADM的细胞毒性。结果表明，在Hs578T细胞中VPA可以通过增强GJ功能而显著增强ADM的细胞毒性。⑶Annexin V/PI双染结果显示在高密度接种（有GJ形成）条件下，用5 mM VPA增强GJ功能后，1μM ADM处理Hs578T细胞8 h，细胞早期凋亡率显著高于1μM ADM单用组（P<0.01）；而在低密度接种（无GJ形成）条件下，用5 mM VPA预处理组诱导的细胞早期凋亡率与1μM ADM单用组相比无显著差别（P>0.05）。Hochest33258荧光染色结果显示在有GJ形成的Hs578T细胞中，用5 mM VPA增强GJ功能后，1μM ADM作用Hs578T细胞24 h，细胞晚期凋亡率显著高于1μM ADM单用组（P<0.01）；单用VPA组对细胞凋亡无影响。结果表明，在Hs578T细胞中VPA可以通过增强GJ功能而显著增强ADM诱导的细胞凋亡作用。⑷Western blotting结果显示VPA（1.25～5 mmol/L）处理Hs578T细胞24 h，可以显著增强Cx43总蛋白的表达（P<0.01）；5 mmol/L VPA预处理Hs578T细胞6 h、12 h和24 h，可以显著增强Cx43总蛋白的表达。细胞免疫荧光结果显示VPA（1.25～5 mmol/L）作用Hs578T细胞24 h，可显著增强细胞胞膜Cx43蛋白的表达；5 mM VPA预处理Hs578T细胞6 h、12 h和24 h，可显著增强胞胞膜Cx43蛋白的表达。 Western blotting结果显示VPA（0.625、1.25、2.5、5、10 mM）处理Hs578T细胞24 h，可以显著降低Src激酶的表达（P<0.01）；5 mM预处理Hs578T细胞6 h、12 h和24 h，可以显著降低Src激酶的表达（P<0.01）。提示，VPA可以通过增强Hs578T细胞Cx43总蛋白的表达和胞膜Cx43的表达而增强细胞GJ功能；也可能通过抑制Src激酶表达而增强GJ功能。MTT检测结果显示PP2在0～10 mmol/L的浓度范围内并不影响细胞存活率。细胞接种荧光示踪结果显示PP2（1～8μmol/L）处理Hs578T细胞24 h，可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递（P<0.01）。与对照组相比，PP2处理后细胞的荧光传递功能分别增加了60.12%、100.24%、120.14%和170.21%；8μmol/L PP2预处理Hs578T细胞6 h、12 h和24 h，可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递功能（P<0.01)。与对照组相比，VPA预处理不同时间后细胞的荧光传递功能分别增加了41.21%、70.23%和122.13%。提示，在Hs578T细胞中PP2可以显著增强GJ功能。Western blotting结果显示PP2（1～8μmol/L）处理Hs578T细胞24 h，可以显著降低Src激酶的表达（P<0.01）；8μmol/L PP2预处理Hs578T细胞6 h、12 h和24 h，可以显著降低Src激酶的表达（P<0.01）。PP2（1～8μmol/L）处理Hs578T细胞24 h，对Cx43蛋白的表达无显著影响（P>0.05）。提示，在Hs578T细胞中抑制Src激酶表达可以显著增强GJ功能。
　　结论：①在Hs578T细胞中VPA可以通过增强细胞GJ功能而显著增强ADM的细胞毒性。②在Hs578T细胞中VPA可以通过增强细胞GJ功能而显著增强ADM诱导的细胞凋亡作用。③在Hs578T细胞中，GJ功能的增强与Cx43蛋白表达增加及Src激酶表达抑制有关。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

1. 阿霉素

2. 乳腺癌与缝隙连接（GJ）

3. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂

4. Src激酶

材料与方法

1 材料

2 主要仪器和设备

3 方法

4 统计学处理方法

实验结果

1. V.P7A0 对Hs578T细胞GJ功能的影响

2. VPA对ADM细胞毒性的影响

3. VPA对ADM诱导细胞凋亡的影响

4. VPA改变GJ功能的可能机制

讨论

结论

课题创新点

参考文献

致谢

附录 A主 要 英 文 缩 略 词 表

附录B主要试剂配制方法

附录C个人简历及发表的文章

附录D 综述： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞缝隙连接功能影响的研究进展