c-Src磷酸化己糖激酶增加其活性进而促进肿瘤的发生和转移

摘要

c-src是首个在细胞内被发现与病毒型癌基因v-src同源的原癌基因，其编码的蛋白质c-Src是一个非受体型的酪氨酸激酶。c-Src的过度激活如蛋白水平或者激酶活性的增加促进了多种肿瘤的发生、发展以及转移。目前肿瘤细胞的代谢更依赖于糖酵解被大家所公认，但是c-Src是否调节了肿瘤细胞这种代谢转变还不清楚。
　　在本论文中，发现c-Src在激活的情况下能够和己糖激酶(Hexokinase:HK)相互结合，并且磷酸化Ⅰ型己糖激酶(HK1)的酪氨酸732位点以及Ⅱ型己糖激酶(HK2)的酪氨酸686位点。通过检测HK的催化活性，发现c-Src介导的酪氨酸磷酸化修饰使得HK1和HK2的酶活性大大增加，能够更快速的将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖。从机理上来讲，HK1 Y732位点的磷酸化引起的构象改变破坏了HK1寡聚体的结构，从而降低了其对葡萄糖的Km值，同时增加了最大反应速率。将HK1和HK2上被c-Src磷酸化的酪氨酸位点进行突变会显著削弱c-Src促进的糖酵解、细胞增殖、肿瘤发生以及转移;而且对临床肿瘤样本进行免疫组化分析发现，肿瘤组织中HK1732位点的磷酸化水平显著高于相应的正常组织。另外，由于HK1对葡萄糖的Km值(0.03 mM)明显低于HK2(0.3 mM)，发现在葡萄糖极度缺乏的情况下，HK1而不是HK2对肿瘤细胞的存活具有重要作用。
　　综上，对c-Src调节HK促进糖酵解的分子机理和功能进行了深入的研究，不仅为肿瘤细胞依赖于糖酵解提供了新的证据，还为c-Src促进肿瘤的发生和转移提供了新的视角，对开发新的肿瘤治疗药物提供了有益的理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 原癌基因c-Src

1．1．1 简介

1．1．2 c-Src活性的调节

1．1．3 c-Src的功能

1．1．4 c-Src与肿瘤的关系

1．1．5 c-Src抑制剂在l肿瘤治疗中的应用

1．2 已糖激酶(Hexokinase)

1．2．1 简介

1．2．2 己糖激酶的结构和调节

1．2．3 Ⅰ型、Ⅱ型己糖激酶的功能

1．2．4 HK与肿瘤治疗

1．3 立题背景

第二章材料和方法

2．1 基因克隆

2．1．1 质粒载体

2．1．2 PCR反应

2．1．3 琼脂糖凝胶电泳分离DNA，鉴定DNA片段大小

2．1．4 DNA片段回收

2．1．5 DNA连接

2．1．6 DNA转化

2．1．7 质粒提取

2．1．8 构建shRNA质粒和点突变质粒

2．2 细胞实验

2．2．1 质粒转染

2．2．2 慢病毒包装与感染

2．2．3 细胞培养

2．3 蛋白质相关实验

2．3．1 免疫共沉淀(Co-ilmmoprecipitation，Co-IP)

2．3．2 蛋白质的SDS-PAGE电泳与western blot分析

2．4 HK活性检测

2．5 葡萄糖摄入量检测

2．6 BrdU细胞增殖实验

2．7 MTT assay

2．8 蛋白质复合体的体外交联

2．9 裸鼠移植瘤实验

2．10 原核表达蛋白质的纯化和GST-pull do n assay

2．11 NMR分析2-13C glucose的代谢途径

2．12 免疫荧光染色

2．13 transwell、划痕实验和小鼠肺转移模型

2．14 常用药品和试剂

2．15 数据的统计学处理

第三章 结果与讨论

3．1 实验结果

3．1．1 c-Src能够和HK(己糖激酶)相互作用

3．1．2 c-Src能够磷酸化HK

3．1．3 c-Src磷酸化HK1的酪氨酸732位点

3．1．4 c-Src调节的HK磷酸化能够促进HK的酶活性

3．1．5 c-Src改变HK1的动力学参数而影响它的酶活性

3．1．6 HK的磷酸化促进葡萄糖的摄入

3．1．7 c-Src磷酸化HK促进肿瘤的生长

3．1．8不同葡萄糖浓度依赖于不同的HK

3．1．9 c-Src调节的HK磷酸化促进了肿瘤的转移

3．1．10 HK1和HK1的磷酸化与肿瘤的发生具有密切的关系

3．2 讨论

图表索引

参考文献

致谢