乙型肝炎病毒体外感染模型的构建、优化及初步应用

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是危害人类健康的重要公共卫生问题，尽管现有的预防性疫苗已显著减少了新发HBV感染，全球仍有约2.4亿的慢性HBV感染者需要得到有效的治疗。鉴于现有慢乙肝治疗药物只能控制病情发展而难以实现临床治愈，发展更加有效的Anti-HBV新药是当前HBV的研究重点方向。建立和发展能实现HBV完整生命周期的细胞和动物模型对Anti-HBV治疗新技术的发展至关重要。其中，支持HBV感染和复制的细胞模型是研究HBV与宿主相互作用、筛选和评估HBV感染治疗药物、评估抗体中和活性的重要工具。除原代肝细胞外，分化的HepaRG细胞与外源表达HBV功能性受体人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（Sodium taurocholate cotransportingpolypeptide，NTCP）的HepG2细胞(HepG2-NTCP)是目前最为常用的两种HBV易感细胞，但现有基于上述两种细胞的体外HBV感染系统尚存在感染效率低、操作繁琐等不足，有待进一步改进。本研究拟通过构建新的HBV易感细胞株、筛选能增强HBV感染的小分子促进剂和优化感染条件等手段建立更为高效的HBV细胞感染模型，并初步应用于Anti-HBV药物的筛选评估和慢性乙肝病人血清病毒感染性与其治疗应答相关性的探索。
　　本研究分为两个部分，分别对基于HepG2-NTCP和HepaRG的HBV体外感染模型进行系统优化和应用探索。其中第一部分针对是HepG2-NTCP细胞模型的构建、优化和应用。人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白是HepG2细胞中缺少的HBV功能性受体。2012年，Huan Yan等最早发现在HepG2、Huh7等人肝癌细胞株中外源性表达NTCP可使其获得HBV易感性，为构建新的HBV体外感染模型奠定了基础。但此前报道的基于HepG2-NTCP细胞株的体外感染模型感染效率较低，仅为10-20％左右，且对病人血清HBV的易感性较差。本研究从下述三个方面对基于HepG2-NTCP细胞的感染模型进行了系统优化，包括:(1)构建了四环素诱导表达型的HepG2-NTCP细胞株，将NTCP编码序列与IRES驱动的红色荧光蛋白(mCherry)构建于四环素诱导启动子调控的双顺反子表达框中，利用慢病毒系统将该表达框稳定整合至HepG2-TetOn细胞，通过流式细胞分选和细胞克隆化获得了稳定整合的HepG2-2B1细胞株。该细胞株在Doxycycline(Dox)诱导后，能高水平表达NTCP，并支持HBV感染，感染率为30％左右。(2)评估了系列小分子化合物对HBV体外感染的作用。发现采用9-cis-RA和CD437两种维甲酸受体(Retinoic acid receptors，RAR)激动剂类药物处理HepG2-2B1细胞，能显著提高其对HBV的易感性。其中，9-cis-RA需要与DMSO联合使用，而CD437则无需DMSO协同即可大幅提高感染后细胞的HBV抗原(HBeAg和HBsAg)表达水平、HBcAg免疫荧光染色阳性率及细胞内外病毒DNA/RNA水平。(3)优化了感染程序，发现在细胞处于悬浮状态时进行HBV孵育（悬浮感染）可显著提高易感性，并可与药物处理产生协同增强作用。通过以上三个方面的改进，我们建立了基于HepG2-NTCP的HBV高效感染体系，其中CD437处理的悬浮感染条件，可将HBV感染HepG2-2B1细胞的感染率（感染后第12天细胞HBcAg免疫荧光染色阳性率）从34.5％提升到98.3％，同时显著提高（＞5倍以上）感染后细胞的HBsAg、HBeAg分泌水平及胞内HBV RNA（包括pgRNA和total HBV RNA）、HBV DNA（包括core DNA和cccDNA）水平。
　　为研究优化感染条件促进HBV感染的分子机制，笔者采用报告基因方法和mRNA转录组测序分析了药物处理对外源及内源基因表达水平的影响。结果显示，CD437处理可显著增强多种外源启动子活性(CMV、CAG、SV40、CMVTRE3G)，从而增强其下游基因表达水平。此外，研究还发现CD437处理能同时增强转染了HBV1.3倍基因组克隆的HepG2细胞的HBeAg和HBsAg表达水平，表明其对HBV启动子也有促进作用。对DMSO、DMSO+9-cis-RA、CD437处理后HepG2-HepG2-2B1细胞进行mRNA转录组测序，结果显示相比于未处理细胞，DMSO、CD437处理均可显著增强包括NTCP在内的多个与HBV感染及早期复制相关的宿主基因的转录水平。笔者构建了药物处理后显著上调的14个基因的cDNA表达质粒，转染HepG2-HepG2-2B1细胞进行感染验证，结果发现其中9个基因(BCL2A1、BCL2L1、NUP155、CHORDC1、PON2、TRIM26、SART3、MTA2、HNF4A)的过表达可以增强HBV在HepG2-2B1细胞中的感染。综上所述，笔者的研究结果表明CD437增强HBV感染复制相关宿主基因的表达，同时促进HBV的转录和表达，从而起到增强HBV感染的效果。
　　进一步评估发现，优化后的HepG2-2B1感染体系可以支持HBV携带者血清的直接感染分析，为进一步分析慢性乙肝病人血清病毒感染性特征提供了重要工具。采用此模型，本研究对104例接受长效干扰素治疗的HBeAg阳性的慢性乙肝患者基线血清病毒（HBV DNA水平均大于108 copies/mL）的体外感染能力进行了评估，其中42(40.3％)例基线血清可检测到感染后HBeAg水平的升高（成功感染标志）。结合基线血清能否实现体外成功感染与长效干扰素治疗应答结局进行分析，发现HBeAg阳性的慢乙肝病人基线血清病毒感染性与干扰素治疗后发生联合应答(HBeAg血清学转换及HBV DNA降至检测下限)具有显著的相关性，基线血清病毒感染性越弱，干扰素治疗后越容易发生联合应答。因此，基线病毒感染性可能可以作为预测干扰素治疗应答的另一个指标。在本研究中，qAnti-HBc预测干扰素治疗后发生联合应答的AUROC值为0.677(95％ CI:0.576-0.779，p＜0.001)，基线病毒感染力预测的AUROC为0.663(95％ CI:0.558-0.767，p＜0.001)，而两者联合预测的AUROC值为0.724(95％ CI:0.626-0.821，p＜0.001)。因此，两者联合预测的准确性高于qAnti-HBc或基线病毒感染力单独作为预测指标的准确性。
　　本研究第二部分是基于HepaRG细胞的HBV体外感染模型的优化和初步应用。HepG2细胞恶性程度较高，许多先天免疫应答相关信号通路缺失，不适合用于宿主对HBV感染的先天免疫应答机制的研究，本部分研究旨在构建一个更接近原代肝细胞的细胞模型，与HepG2-2B1形成优势互补。通过对HepaRG进行基因改造，将HNF4A和FoxM1基因整合至HepaRG细胞，筛选获得一株不依赖于DMSO即可完成分化并支持HBV感染的HepaRG-M14A细胞株。与原始HepaRG相比，HepaRG-M14A生长分化速率更快，并且全部分化成为类肝细胞而不基本向类胆管细胞方向分化。分化两周后的HepaRG-M14A细胞肝细胞特异基因的表达显著提升且具有成熟肝细胞的功能，并且能够在FRG小鼠中较快建立生长优势，实现重建。
　　分化两周的HepaRG-M14A与HepaRG相比，NTCP及多个与HBV感染及早期复制相关的基因的表达均有不同程度的提升，且无须DMSO诱导即可支持HBV的感染。悬浮感染和病毒孵育时添加DMSO可以提升HepaRG-M14A细胞对HBV的易感性。利用HepaRG-M14A细胞对HBV感染先天免疫应答相关的研究发现，HBV感染早期存在较为短暂、微弱的的干扰素反应和干扰素诱导基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表达，JAK/STAT和NF-κB信号通路都参与到HBV的免疫应答中。HepaRG-M14A细胞中模式识别受体(Pathogenrecognition receptor，PRR)的表达与HepG2相比更接近于原代肝细胞，大部分PRR激动剂在M14A细胞中都具有抑制HBV感染的作用，其中抑制效果最显著的是TLR-1/2，3，4，2/6和RIG-I/MDA-5的激动剂。
　　综上所述，本研究建立并发展了两种不同的HBV体外感染模型和感染方法，并对HBV在细胞模型中的感染特征进行了系统的阐述。利用HepG2-2B1细胞发现了HBV感染力在干扰素治疗应答预测中的价值，利用HepaRG-M14A细胞初步探讨了HBV感染的先天免疫应答特征。这两个体外感染模型互为补充，适用于不同的研究范围，为HBV感染机制研究及Anti-HBV新药研发提供了新工具。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

1 乙型肝炎病毒

1．1 HBV基因组

1．2 HBV的病毒结构

1．3 HBV生命周期

1．4 HBV基因的编码蛋白

1．5 HBV的基因型

2 乙型肝炎病毒感染

2．1 HBV感染的全球流行情况

2．2 HBV的传播方式

2．3 HBV感染产生的免疫应答

2．4 急性乙型肝炎病毒感染和慢性乙型肝炎病毒感染

2．5 HBV感染的预防

2．6 HBV感染的抗病毒治疗

3 乙型肝炎病毒研究模型

3．1 HBV体外研究模型

3．2 HBV体内研究模型

4 本研究的目的、意义和思路

第二章 材料和方法

1 材料

1．1 研究中用到的主要仪器

1．2 主要耗材

1．3 菌株、质粒、细胞株及实验动物

1．4 分子及细胞生物学实验常规试剂

1．5 实验常规溶液及培养基配制

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 HBV的DNA、RNA及病毒抗原检测

2．3 HBV感染实验

2．4 慢病毒、腺病毒及腺相关病毒载体的构建与感染

2．5 肝细胞功能评估

2．6 基因表达检测

2．7 Myr-PreS1多肽结合实验

2．8 基于WST-8的细胞毒性检测

2．9 FRG小鼠移植与免疫组化

2．10 转录组测序及分析

2．11 数据处理统计学分析

第三章 结果与分析

第一部分 HepG2-NTCP感染模型的建立、优化与应用

1 HepG2-NTCP细胞株的构建、筛选及性质鉴定

2 HepG2-281感染模型的优化

3 HepG2-281感染模型应用

4 第一部分小结

第二部分 可用于HBV感染先天免疫应答研究的新型感染模型

5 HepaRG-M14A细胞模型的构建

6 HepaRG-M14A细胞株性质鉴定

7 HepaRG-M14A细胞株转录组测序分析

8 利用HepaRG-M14A细胞探索HBV感染的先天免疫应答特征

9 第二部分小结

第四章 讨论

1 HepG2-2B1细胞株特点

2 基于转录组测序研究HBV感染过程的宿主因子

3 基线血清病毒感染性在干扰素治疗应答预测中的价值

4 HepaRG-M14A细胞株特点

5 细胞针对HBV／HDV感染的先天免疫应答反应

6 细胞模型在Anti-HBV新药研发中的应用

第五章 结论与展望

参考文献

在校期间的科研成果

致谢