鼠源AAFP蛋白对IgE介导小鼠过敏反应的干预作用及机制研究

摘要

目的: 通过交联过敏细胞表面的Fc?RI受体和抑制性FcγRIIb受体，可激活FcγRIIb受体的负调控信号，信号途径中5'肌醇磷酸酶（SHIP）的磷酸化使Fc?RI信号途径中的关键信号分子脾酪氨酸激酶（Syk）脱磷酸化，阻断Syk启动的细胞脱颗粒作用，进而阻止过敏反应的发生。据此，本文构建一个鼠源的抗过敏融合蛋白（mouse anti-allergy fusion protein，mAAFP），mAAFP由小鼠IgE Fc段和IgG Fc段融合而成，理论上可同时作用于过敏细胞表面Fc?RI和Fc?RIIb受体，使其交联，达到抗过敏作用。本文通过探究mAAFP对IgE介导小鼠过敏反应的干预作用及其作用机制，以期获得药效良好作用机制清晰的结果，为IgE介导过敏性疾病药物的研究提供新的方向。
　　方法:
　　（一）融合蛋白mAAFP的构建及表达
　　利用基因工程技术构建mAAFP重组蛋白，并用Invitrogen公司的Flp-InTM CHO表达系统进行蛋白表达。表达产物用Protein A亲和层析纯化，用高效液相色谱技术（HPLC）分析其纯度。
　　（二）融合蛋白mAAFP对IgE介导小鼠过敏反应的抑制作用及机制研究
　　1. BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被动皮肤过敏反应实验
　　采用BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被动皮肤过敏反应（PCA）模型，通过观察mAAFP对两种小鼠PCA反应的抑制效果，探究mAAFP对IgE介导过敏反应的抑制作用及其作用机制。
　　2. mAAFP对抗原诱导的体外肥大细胞脱颗粒时Syk、SHIP磷酸化水平的影响
　　采用抗原致大鼠肥大细胞（RBL-2H3）脱颗粒模型。用mAAFP处理致敏的RBL-2H3细胞，过敏原激发细胞，分别在2 min、5 min、10 min检测mAAFP对Syk和SHIP磷酸化水平的影响，进一步探讨mAAFP的作用机制。
　　（三）mAAFP对花生致小鼠过敏反应的干预作用
　　采用全花生提取物致C57BL/6小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠过敏模型，以过敏症状评分、血浆中组胺的含量、体温为考察指标，探究mAAFP对花生引起的C57BL/6小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠过敏的干预效果。
　　（四）mAAFP对卵白蛋白（OVA）致小鼠过敏性哮喘的干预作用
　　采用卵白蛋白（OVA）致BALB/c小鼠过敏性哮喘模型，以肺泡灌洗液中炎性细胞数目、肺组织病理损伤、气道高反应性（AHR）为考察指标，探究mAAFP对OVA致小鼠过敏性哮喘的干预效果。
　　结果:
　　（一）融合蛋白mAAFP的构建及表达
　　成功构建mAAFP蛋白的Flp-InTM CHO稳定表达系统。Protein A亲和纯化后，蛋白产物纯度为97.319％，可用于后续动物实验研究。
　　（二）融合蛋白mAAFP对IgE介导小鼠过敏反应的抑制作用及机制初探
　　1. BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被动皮肤过敏反应实验
　　成功构建了BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被动皮肤过敏（PCA）反应模型。在BALB/c小鼠中，mAAFP低、中、高剂量组抑制PCA反应率分别为44.5%、65.6%、96%。说明mAAFP对IgE介导的过敏反应有良好的抑制作用。
　　在FcγRIIb基因缺陷小鼠中，mAAFP低、中、高剂量组对PCA反应均无抑制作用，说明mAAFP对PCA反应的抑制作用依赖FcγRIIb受体介导的抑制效应。
　　2. mAAFP对抗原诱导的体外肥大细胞脱颗粒时Syk、SHIP磷酸化水平的影响
　　在抗原致大鼠肥大细胞（RBL-2H3）脱颗粒模型中，无论激发2min、5min、10min均一致的观察到mAAFP降低Syk磷酸化水平，升高SHIP磷酸化水平。
　　（三）融合蛋白mAAFP对花生致小鼠过敏反应的干预作用
　　实验结果表明mAAFP显著减轻小鼠过敏反应的临床症状，显著抑制血浆中组胺的释放，显著抑制全花生提取物致敏C57BL/6小鼠体温的快速下降。说明mAAFP对IgE介导的花生急性过敏反应具有抑制作用。但是mAAFP对全花生提取物致敏FcγRIIb基因缺陷小鼠的急性过敏反应没有抑制作用，说明mAAFP在FcγRIIb基因缺失的情况下无法发挥药效。
　　（四）融合蛋白mAAFP对卵白蛋白（OVA）致小鼠过敏性哮喘的干预作用
　　实验结果表明mAAFP显著降低了肺泡灌洗液中炎性细胞的数目，明显改善小鼠肺组织的病理损伤，减轻由OVA诱导的肺组织气道炎症。mAAFP缓解了OVA诱导的AHR，提高了肺顺应性，降低肺阻力。
　　结论: 结果表明，mAAFP对小鼠花生过敏及过敏性哮喘均有一定的干预作用。机制研究证实，mAAFP的抗过敏作用是通过交联Fc?RI和FcγRIIb受体，促进SHIP的磷酸化，使得Fc?RI信号途径中的关键信号分子Syk发生脱磷酸化，从而阻断了Syk启动的细胞脱颗粒作用，阻止了过敏反应的发生。
　　该蛋白的疗效和作用机制与设计思路一致。该蛋白的成功研制，将为IgE介导过敏性疾病的治疗开辟新的途径。

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封面

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中文摘要

前言

1. IgE介导过敏性疾病的流行状况

2. IgE介导过敏性疾病的发病机理

3. IgE介导过敏性疾病的药物治疗手段

4. Fcγ RIIb受体在调节IgE介导过敏反应中的作用

5. 立题依据

6. 创新点

第一部分 融合蛋白mAAFP的构建及表达

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3. 结果

1.4 小结

第二部分 融合蛋白mAAFP对IgE介导小鼠过敏反应的抑制作用及机制研究

2.1 BALB/c小鼠及Fc?RIIb基因缺陷小鼠被动皮肤过敏反应实验

2.2 mAAFP对抗原诱导的体外肥大细胞脱颗粒时Syk、SHIP磷酸化水平的影响

第三部分 融合蛋白mAAFP对花生致小鼠过敏反应的干预作用

3.1实验材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 小结

第四部分 融合蛋白mAAFP对OVA致小鼠过敏性哮喘的干预作用

4.1 实验材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 小结

总结与讨论

参考文献

致谢

缩略语词表

英文摘要

攻读硕士学位期间科研成果

声明

附：综述 常见IgE介导过敏性疾病的药物治疗