降钙素基因相关肽转基因对大鼠移植供肺保存和同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的影响

摘要

供肺保存时间不长和移植后缺血再灌注损伤(IRI)仍然是肺移植面临着的问题，解决这些问题，肺移植的成功率会大大提高。目前临床肺移植供肺保存安全时间通常仅4-6小时，主要涉及低温保存和冷缺血损伤。移植术后IRI又是导致肺移植失败的主要原因之一。近年来基因治疗在器官移植领域研究取得了迅速的发展。降钙素基因相关肽(CGRP)具有扩血管、抗炎和免疫特性。本课题构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的降钙素基因相关肽(CGRP)重组腺病毒(Ad)载体(Ad5-CGRP-EGFP)，并采用改良技术建立大鼠肺移植供肺保存和袖套法同种异体左肺移植动物模型，通过荧光观察CGRP的表达，研究腺病毒介导CGRP转基因对肺移植过程中的供肺保存的低温和冷缺血损伤的影响和移植后再灌注损伤的防治作用。 第一部分增强型绿色荧光蛋白标记的降钙素基因相关肽重组腺病毒载体(Ad5-CGRP-EGFP)的构建 目的:研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的降钙素基因相关肽(CGRP)重组腺病毒(Ad)载体(Ad5-CGRP-EGFP)的构建。 方法:通过质粒提取、测序鉴定CGRP，利用细菌内质粒间同源重组法构建EGFP标记的Ad5-CGRP-EGFP。 结论:本研究证实利用细菌内同源重组法成功地构建腺病毒载体Ad5-CGRP-EGFP并通过测序，为进一步研究CGRP的基因治疗奠定了基础。 第二部分大鼠肺移植供肺保存和改良袖套法同种异体左肺移植模型的建立 目的:采用改良技术建立大鼠肺移植供肺保存和袖套法同种异体左肺移植动物模型。 方法:对供肺获取、套管制作、自体肺切除、血管和气管袖套套接技术进行改进。一组15例大鼠左供肺获取后置于4℃的LPDG液保存12小时取材检测肺湿干重比(W/D)和光镜、电镜下肺组织结构变化；另一组30例清洁级SD大鼠左供肺获取后置于4℃的LPDG液保存6小时，随后行肉眼直视下同种异体左肺移植术，再灌注4小时后阻断右肺门，分别测定阻断前后气道压力、血气分析变化和肺W/D及光镜、电镜下肺组织结构变化。分别评价该模型复制供肺保存和移植物缺血再灌注损伤的能力。 结论:本研究模型符合大鼠肺移植模型建立的优点，全部操作均在肉眼直视下无需显微镜辅助单人完成：供肺的获取较为快速且几乎没有热缺血时间；使用的套管更简单，套管技术趋于简化：自体肺切除重点保护肺静脉，增加了成功率；肺移植时血管套接技术成功率高；整体手术时间操作缩短。该模型复制出肺保存和移植肺缺血再灌注损伤的反应变化，是适合肺保存、肺缺血再灌注损伤等研究的理想模型。 第三部分降钙素基因相关肽转基因对大鼠肺移植供肺保存的影响 目的:观察腺病毒介导CGRP转基因对大鼠肺移植供肺保存的影响及其可能的作用机制。 方法:以SD大鼠左肺为供体，采用改良技术建立大鼠肺移植供肺保存模型。设立假手术对照组(A组)：空白对照组(B组)供肺离体经肺静脉逆行灌注4℃的LPDG液；空病毒载体组(C组)和基因转染组(D组)分别行供肺离体经肺静脉逆行灌注经4℃的LPDG液稀释的空病毒载体和重组腺病毒载体3.2×10<'9>vp/ml。灌注后供肺置于4℃的LPDG液保存12小时后切取肺组织检测指标。分别测定：肺W/D、肺组织中超氧化物岐化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性：光镜和电镜检查移植物病理组织学变化；荧光显微镜下观察标本绿色荧光变化，了解基因转染情况；放射免疫测定肺组织CGRP含量；免疫组化检测TNF-a、IL-10表达情况；TUNEL法检测细胞凋亡。 结论:荧光观测显示腺病毒介导CGRP转基因能有效地表达CGRP目的基因，明显减轻低温和冷缺血对供肺的损害，保护内皮细胞、减轻移植物的结构破坏，下调TNF-a表达，上调IL-10表达，对大鼠肺移植的供肺保存起保护作用。 第四部分降钙素基因相关肽转基因对大鼠同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的影响 目的:观察腺病毒介导CGRP转基因对大鼠同种异体左肺移植物缺血再灌注损伤的影响并探讨其作用机制。 方法:以SD大鼠为供受体，采用改良袖套法技术建立同种异体左肺移植模型。设立假手术对照组(A组)：空白对照组(B组)行离体供肺肺静脉4℃的LPDG液逆行灌注。空载体对照组(C组)和基因转染组(D组)分别行肺静脉逆行灌注经4℃的LPDG液稀释的空病毒载体和重组腺病毒载体3.2×10<'9>vp/ml。灌注后供肺于4℃的LPDG液中保存6小时后行左肺原位移植，移植肺再灌注4小时后，阻断右肺门，测量气道压力，作动脉血气分析，测PaO<,2>、PaCO<,2>。随后处死大鼠。分别测定：肺W/D比率、肺组织中SOD活性、MDA含量、MPO活性：光镜和电镜观察移植物病理组织学变化；荧光显微镜下观察标本绿色荧光变化了解基因转染情况：放射免疫法测定肺组织CGRP含量；免疫组化检测TNF-a、IL-10表达情况；TUNEL法检测细胞凋亡。 结论:荧光观测显示腺病毒介导CGRP转基因能有效地表达CGRP目的基因，CGRP通过其扩血管、抗炎及免疫特性，保护内皮细胞、减少炎症细胞浸润、减轻移植物局部炎性反应，下调TNF-a表达，上调IL-10表达，减少细胞凋亡，明显减轻缺血再灌注损伤对供肺的损害，对大鼠肺移植的供肺缺血再灌注损伤起保护作用。因此应用腺病毒介导转基因技术在移植肺局部表达CGRP可成为预防和减轻同种异体肺移植供肺保存的低温和冷缺血损伤及供肺缺血再灌注损伤的一种新策略。

目录

声明

前 言

第一部分增强型绿色荧光蛋白标记的降钙素基因相关肽重组腺病毒载体(Ad5-CGRP-EGFP)构建

第二部分大鼠移植供肺保存和改良袖套法左肺原位移植模型的建立

第三部分降钙素基因相关肽转基因对大鼠移植供肺保存的影响

第四部分降钙素基因相关肽转基因对大鼠同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的影响

结 论

参考文献

致谢

综述