半巢氏甲基化特异性PCR在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用及甲基化逆转的实验研究

摘要

目的：旨在应用半巢氏甲基化特异性聚合酶链反应(Hemi-nested methylation specific PCR，Hn-MSP)检测急性白血病患者p15基因甲基化状态，探讨p15基因甲基化或缺失与白血病发生、发展可能的关系；探讨VPA单药和与AS<,2>O<,3>联合对急性T细胞白血病细胞株细胞的增殖抑制作用以及VPA是否有去甲基化作用或协同AS<,2>O<,3>的甲基化逆转作用，从而诱导沉默基因重新表达。 方法：采用半巢氏甲基特异性聚合酶链反应和基因组硫化后直接测序(Bisulfit-sequencing PCR，BSP)检测急性白血病患者和部分恶性血液病细胞株p15基因甲基化状态，并分析Hn-MSP的敏感性和特异性；生长曲线、MTT法检测VPA和AS<,2>O<,3>对细胞的生长和增殖抑制，并应用金正均的Q值公式探讨两药联合是协同作用还是拮抗作用；利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨VPA对细胞周期的影响。RT-PCR检测急性T细胞白血病细胞株经不同药物处理前后p15、甲基转移酶1(DNMT-1)、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达变化；Hn-MSP观察用药前后甲基化水平的变化等。 结论： 1)半巢氏MSP方法检测基因甲基化状态灵敏度高、特异性强，值得在临床应用。 2)p15基因甲基化状态在急性白血病患者，尤其是复发病人，有较高的检出率，而正常人较少发生甲基化，p15基因甲基化可作为AL病程进展、复发、预后的指标之一。 3)VPA可能通过降低DNMT-1和DNMT3B的活性诱导p15基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复其活性，从而实现其细胞周期调控功能，将细胞阻滞于GO-G1/G2-M期，抑制肿瘤细胞的增长； 4)AS<,2>O<,3>和VPA两药联用对细胞增殖抑制表现出协同相加作用，临床上有待进一步实践。

目录

声明

引言

第一部分应用半巢氏MSP对部分恶性血液细胞株p15基因甲基化的筛选

材料与方法

结果

讨论

第二部分半巢氏MSP在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用

材料与方法

结果

讨论

第三部分VPA和AS2O3对人急性T细胞白血病细胞株增殖、活力和细胞周期的影响

材料和方法

结果

讨论

第四部分VPA单药和联合AS2O3诱导p15基因去甲基化转录调节作用机制的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

课题综述