硒化壳聚糖对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞的作用及其机制探讨

摘要

急性早幼粒细胞性白血病(APL)是急性白血病中的一种特殊类型，约占髓细胞性白血病的10％。 95％以上的APL具有特征性的t(15：17)染色体异位，即位于15号染色体上的早幼粒细胞白血病(PML)基因与位于17号染色体上的维甲酸受体α(RAR α)基因相互异位，所形成的PML-RARα融合基因表达的融合蛋白分子量约为110KD，具有一定的酪氨酸激酶活性，增高的酪氨酸激酶活性可使融合蛋白自身及细胞内多种底物分子磷酸化，进而募集和结合许多转接蛋白分子，从而激活许多相关的细胞信号通路，使细胞异常增殖，在APL的发病和治疗中起着关键作用。故而降低APL细胞内融合蛋白含量，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断其可能的细胞信号传导途径已成为当前针对分子靶点进行治疗的策略。 硒化壳聚糖是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下，以混合金属离子为催化剂制备而成的一种低分子量有机硒，可有效克服无机硒不易被细胞吸收，活性和毒性范围较窄，致死量相对较小等缺点。硒和砷属同族，而砷在临床上早已做为一种抗APL药物使用。故硒化壳聚糖也应具有抗APL的作用，且毒副作用应该比无机硒和砷小得多。 本课题以表达PML-RAR α融合蛋白的NB4细胞为试验对象，全面观察硒化壳聚糖对NB4细胞增殖、凋亡和分化的影响，以及硒化壳聚糖与常用的化疗药合用对NB4细胞作用的特点，探索硒化壳聚糖对NB4细胞作用的最适浓度及对融合基因、融合蛋白、细胞周期蛋白以及相关信号传导通路的影响等，为硒化壳聚糖的临床应用奠定基础。 研究结果表明，硒化壳聚糖可明显升高细胞内GSH-PX活力，降低MDA含量和SOD活性。在本实验条件下，50mg/L的硒化壳聚糖可诱导NB4细胞向正常成熟细胞方向分化，若增加剂量至100mg/L及以上，药物对细胞则主要产生诱导凋亡方面的作用；硒化壳聚糖和亚硒酸钠对NB4细胞都可产生明显的细胞毒作用，且呈量效和时效关系，它们的IC<,50>分别是103.7mg/L和16.7umol/L，以同等含硒量来比较其效应，则硒化壳聚糖的作用效果约为亚硒酸钠的三倍；以激光共聚焦显微镜、AO/EB荧光染色法、流式细胞仪检测、DNA片段化凝胶电泳测定以及电镜超微结构观察等方法分析表明，硒化壳聚糖可诱导NB4细胞凋亡，阻断细胞于GO/G1期，提示硒化壳聚糖对APL的治疗可能具有一定的价值。硒化壳聚糖与ADM同时合用对NB4细胞可产生单纯相加至增强的协同杀伤效果，尤其是硒化壳聚糖与低浓度ADM的协同作用更为显著。硒化壳聚糖与ADM序贯给药时二药可产生单向协同，但协同效果不如同时合用显著。 本实验结果还显示，1、硒化壳聚糖可明显减少NB4细胞内PML-RARα融合蛋白含量，呈量效、时效关系，但硒化壳聚糖对PML-RARα融合基因的转录没有影响。2、硒化壳聚糖可降低NB4细胞内cyclinD1的表达。3、硒化壳聚糖可降低NB4细胞内c-jun和MEK-1信号分子的含量，从而抑制了Ras信号传导通路。4、硒化壳聚糖可减少NB4细胞核内NF-KB的含量，从而抑制了NF-KB信号传导通路。5、硒化壳聚糖可提高NB4细胞内cAMP含量，降低cGMP的含量，增加cAMP与cGMP的比值。6、硒化壳聚糖可使细胞内钙离子浓度呈剂量与时间依赖性提高。7、50mg/L的硒化壳聚糖可增加NB4细胞膜上CD11b抗原分子的表达。以上这些作用可能都与硒化壳聚糖能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，促进细胞分化作用密切相关。 综上所述，硒化壳聚糖可能通过减少NB4细胞内PML-RARα融合蛋白和cyclinD1蛋白的含量，抑制细胞内Ras信号途径和NF-KB信号途径，提高细胞内cAMP含量，降低cGMP的含量，增加cAMP与cGMP的比值以及升高细胞内钙离子浓度等途径来抑制急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4细胞增殖，诱导其凋亡：小剂量硒化壳聚糖尚可通过增加NB4细胞膜上CD11b表达来诱导其分化，提示硒化壳聚糖可能是一种能够替代无机硒的高效、低毒的APL治疗新药，具有良好的开发前景，硒化壳聚糖对APL的治疗作用值得进一步深入研究。

目录

声明

摘要

前言

第一部分硒化壳聚糖的制备及对NB4细胞的作用

1材料与方法

1.1试剂和仪器

1.2 NB4细胞株及培养条件

1.3硒化壳聚糖的制备和检测

1.4 MTT法观察亚硒酸钠、硒化壳聚糖和壳聚糖的细胞毒作用

1.5硒化壳聚糖对细胞凋亡的观察

1.6 NBT还原法检测硒化壳聚糖对NB4细胞的诱导分化作用

1.7硒化壳聚糖对NB4细胞内各抗氧化指标的影响

1.8数据统计

2结果

2.1硒化壳聚糖的物理形态表征及红外、紫外光谱分析结果

2.2壳聚糖、硒化壳聚糖及亚硒酸钠对NB4细胞的细胞毒作用

2.3硒化壳聚糖对NB4细胞凋亡的影响

2.4硒化壳聚糖对NB4细胞分化的影响

2.5硒化壳聚糖对NB4细胞内各抗氧化指标的影响

3讨论

第二部分硒化壳聚糖与阿霉素的体外联合抗NB4细胞作用

1材料与方法

1.1药品与试剂

1.2细胞株及培养条件

1.3联合用药体外抗癌活性测定

1.4数据分析

2结果

2.1硒化壳聚糖与ADM同时联合给药对NB4细胞增殖抑制的协同作用

2.2硒化壳聚糖与ADM序贯联合用药对NB4细胞增殖抑制作用的影响

3讨论

第三部分硒化壳聚糖对NB4细胞膜CD11b抗原、细胞周期蛋白D1、PML-RARα融合蛋白及相关信号传导通路的影响

1材料与方法：

1.1药品与试剂

1.2仪器

1.3细胞株及培养条件

1.4方法

2结果

2.1硒化壳聚糖对NB4细胞膜表面CD11b抗原的影响

2.2硒化壳聚糖对NB4细胞PML-RARα融合蛋白表达的影响

2.3硒化壳聚糖对NB4细胞CyclinD1蛋白表达的影响

2.4硒化壳聚糖对Ras信号通路的影响

2.5硒化壳聚糖对NB4细胞NF-КB信号分子的影响

2.6硒化壳聚糖对NB4细胞PML-RARα mRNA表达的影响

2.7硒化壳聚糖对NB4细胞其他信号分子的影响

3讨论

结论

论文参考文献

综述硒调控的细胞信号传导途径

个人简介及在学期间发表论文