用GSK-3β特异的RNAi腺病毒载体研究Wnt/β-catenin信号途径对人甲状腺细胞增殖凋亡的影响

摘要

目的： 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具，从转录后水平抑制GSK-3β基因表达，初步探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)，信号途径对人甲状腺细胞增殖凋亡的影响。 方法： 设计合成针对GSK-3βmRNA序列的短发夹RNA(shRNA)编码序列，克隆到腺病毒穿梭质粒中，然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体，在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度；腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞，Western blot法检测其对GSK-3β表达的抑制效应，并探讨不同感染复数(MOI)及病毒感染时间对GSK-3β的抑制效应；利用RNAi腺病毒抑制GSK-3β表达，溴脱氧尿苷(BrDU)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，探讨Wnt/β-catenin信号途径对人甲状腺细胞增殖和凋亡的影响。 结果： 1.成功构建了GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体，在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒，获得高滴度腺病毒上清，测定扩增第二代的病毒液滴度在1.6×1010pfu～5.0×1010pfu之间，可满足后续实验需要。 2.RNAi腺病毒感染人甲状腺细胞后可使GSK-3β表达量明显下降，RNAi腺病毒MOI值为100时可实现对细胞GSK-3β表达的有效抑制；RNAi腺病毒感染后48h开始检测到GSK-3β表达量下降，且随时间延长GSK-3β表达量进一步减少，抑制效应可持续至少6天；RNAi腺病毒感染人甲状腺细胞后β-catenin表达量显著增加。 3.腺病毒感染人甲状腺细胞1day、3day、5day、7day后，RNAi腺病毒组与空病毒组相比，细胞增殖率明显增加(P<0.05)；但流式细胞检测结果提示RNAi腺病毒感染对细胞凋亡的影响不明显。 结论： 构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制GSK-3β基因表达，可以作为研究wnt/β-catenin信号途径的工具；Wnt/β-catenin信号途径对原代培养人甲状腺细胞增殖有重要影响。

目录

声明

摘要

前言

第一部分GSK-3β特异的RNAi腺病毒载体的构建及病毒的包装、扩增和滴度测定

材料与方法

结果

讨论

第二部分Wnt/β-catenin信号途径对人甲状腺细胞增殖和凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

致 谢

综述 Wnt/β-catenin信号转导途径及其与肿瘤相关性的研究进展