hIL-10基因修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

摘要

目的: 建立体外培养、诱导和扩增DA(DarkAgouti)大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法；建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型，用hLK-10基因修饰大鼠骨髓来源的不成熟树突状细胞(imDC)；探讨其诱导同种异体大鼠原位肝移植免疫耐受的情况。 方法: 1.培养、诱导和扩增DA大鼠骨髓来源的DC，经形态学、免疫表型及功能鉴定后，将pIRES2-EGFP-hIL-10质粒转染imDC，检测hIL-10在imDC中的表达。 2.建立改良的大鼠原位肝移植模型和DA大鼠→Lewis大鼠急性排斥反应模型：在原二袖套法的基础上，采用快速切取供肝，一针法连续缝合肝上下腔静脉以及对出血点进行热止血等方法，进行120例大鼠原位肝移植，并观察术后存活率。 3.行以DA大鼠为供体、近交系Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例，随机均分为5组：未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组、及hIL-10转染组；分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2x106个，于肝移植术后3d、7d、10d各处死4只，观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL)，肝脏病理改变，外周血清细胞因子情况，各组除去技术死亡的受鼠，将余下受鼠作生存分析，死亡时取肝脏行病理组织学检查。 结果: 1.成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源DC的方法；经倒置相差显微镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪鉴定，证实所培养细胞为DC。形态学结果显示：DC形态不规则，细胞核大而偏位，细胞表面可见细长树枝状突起。免疫表型结果显示：mDC和imDC表面均表达表面分子OX62，而共刺激分子CD86在mDC呈高表达，在imDC呈低表达。混合淋巴细胞反应(MLR)结果显示：imDC刺激同种异体T淋巴细胞的能力明显弱于mDC(P=0.005)。plRES2-EGFP-hIL-10质粒经基因测序显示其序列与Pubmed基因库的hIL-10序列相符合；经PCR鉴定示在540bp处有明显的条带。荧光显微镜观察显示plRES2-EGFP-hlL-10质粒转染imDC后可见黄绿色荧光。流式细胞术显示转染后DC表面分子CD86和CD80的表达未受影响。转染后MLR显示，hlL-10转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组和空载体组(P=0.024和P=0.033)。ELISA检测IL-10组的hIL-10表达明显高于mDC组、imDC组及空载体组(P=0.004、0.004及0.003)；经Westen-Blot检测有hlL-10蛋白表达。 2.成功建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型。 3.活体观察：移植后的肝脏病理组织学切片显示IL-10组术后仅有较少量的单核细胞浸润，RAI评分2～5分，属非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应，10d开始出现肝细胞再生，有少量的中性粒细胞浸润。肝功能示IL-10组在7d、10d时，肝功能有所恢复，但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义。ELISA检测示，术后7d，IL-10组的血清IL-12浓度均低于对照组、mDC组、imDC组及空载体组(P为0.000、0.000、0.005及0.008)。IL-10组中位生存期40d均长于imDC组(23d)和空载体组(25d)(P均为0.002)。 结论: 1.本实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合，能培养、诱导、扩增大量的DC；hIL-10基因转染imDC能够获得有效的表达，转染后对imDC表型没有明显影响；hIL-10基因转染可明显降低imDC对同种异体T淋巴细胞的反应性。 2.经改良的大鼠原位肝移植方法，手术时间短，成功率高，稳定可靠，建立了比较稳定的大鼠原位肝脏移植模型，可满足本实验的要求。 3.hIL-10基因修饰的imDC能诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受，显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

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前 言

第一部分 大鼠骨髓来源的树突状细胞的体外培养与鉴定

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分hIL-10基因在大鼠树突状细胞中的表达

材料和方法

结 果

讨 论

第三部分hIL-10基因修饰的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

全文总结

参考文献

致 谢

综述 肝移植免疫耐受研究进展